西地那非對(duì)人淋巴管畸形內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的體外研究.pdf

1、研究背景
　　淋巴管畸形(Lymphatic Malformation，LM)是一種先天性的淋巴系統(tǒng)發(fā)育畸形疾病，常導(dǎo)致外貌畸形和功能障礙，甚至危及生命。LM雖為良性病變，但由于病灶常侵入周圍組織或器官，邊界不清，故治療較為困難。2012年，新英格蘭雜志報(bào)道，口服西地那非對(duì)一例淋巴管畸形患兒的治療有效，隨后，西地那非成為淋巴管畸形治療中的研究熱點(diǎn)，該藥物的應(yīng)用為L(zhǎng)M的治療提供了新的選擇，但相關(guān)的作用機(jī)制未見報(bào)道。在病理結(jié)構(gòu)上，淋巴

2、管畸形內(nèi)皮細(xì)胞(LymphaticMalformation Endothelial cells，LMECs)是LM病灶的主要組成細(xì)胞，有研究表明，淋巴管畸形中的LMECs存在異常增殖，常伴有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(Vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3（Vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）的表達(dá)增

3、加，在LM的發(fā)展中具有重要的作用。
　　研究目的
　　通過觀察西地那非對(duì)體外培養(yǎng)的人淋巴管畸形內(nèi)皮細(xì)胞HLMECs增殖的影響，檢測(cè)VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)量的改變，在細(xì)胞水平探究西地那非治療淋巴管畸形的潛能及可能機(jī)制，為西地那非用于LM的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法
　　選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院口腔頜面外科行舌淋巴管畸形切除，并得到手術(shù)后病理證實(shí)的組織標(biāo)本，采用組織塊培養(yǎng)法對(duì)人淋巴管畸形內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體

4、外培養(yǎng);免疫細(xì)胞化學(xué)染色CD-31及淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（LYVE-1）進(jìn)行細(xì)胞鑒定;以不同濃度的西地那非(1、2、5、10μ mol/L)作用于HLMECs后，用倒置顯微鏡觀察HLMECs形態(tài)的變化，MTT比色法和EdU染色法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，Western Blot檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC)及其受體VEGFR-3表達(dá)的變化。使用SPSS21.0軟件包，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析加LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。<

5、br>　　研究結(jié)果
　　組織塊培養(yǎng)72 h后開始有細(xì)胞爬出，細(xì)胞呈多角形，單層貼壁生長(zhǎng)，如鵝卵石狀，生長(zhǎng)速度較緩慢。細(xì)胞傳代后，細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，形態(tài)不規(guī)則，增殖速度加快;免疫細(xì)胞化學(xué)染色法顯示淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體LYVE-1和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31均呈陽(yáng)性表達(dá)，證實(shí)所獲細(xì)胞為該淋巴管畸形內(nèi)皮細(xì)胞;西地那非作用后，隨著藥物濃度的上升，細(xì)胞密度逐漸下降，細(xì)胞增殖速度減慢，2μmol/L細(xì)胞組即出現(xiàn)肉眼可觀測(cè)的密度下降，在10μmol

6、/L時(shí)，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)顆粒狀改變，胞膜變得不完整，細(xì)胞貼壁能力差，且細(xì)胞膨大，形態(tài)不規(guī)則;EdU染色顯示了細(xì)胞增值率隨著西地那非濃度的升高逐漸降低，濃度2μmol/L組開始出現(xiàn)細(xì)胞增殖率下降（P＜0.05），MTT結(jié)果與以上吻合，且顯示相同濃度藥物處理時(shí)，刺激時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.05），說明西地那非對(duì)淋巴管畸形內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制作用兼具濃度依賴性及時(shí)間依賴性;Western Blot顯示VEGF-C自西地那非5μmol/L