17β-雌二醇對人子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖及P21ras和P-ERK表達的影響.pdf

1、背景及目的:子宮內(nèi)膜癌為危害女性健康的女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一,近年來發(fā)病率有明顯上升趨勢。在歐美等某些發(fā)達國家,其發(fā)病率已高居女性生殖道惡性腫瘤之首?！盁o孕激素對抗的雌激素的長期刺激”是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的常見原因之一,但雌激素致子宮內(nèi)膜癌的具體作用機制目前尚不清楚。傳統(tǒng)的觀點認為,雌激素與其受體結(jié)合后在細胞核通過“基因組轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”來發(fā)揮作用,該過程往往需要數(shù)小時才會增加蛋白的合成,故又稱為長期效應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn),雌激素還具有生長

2、因子樣的“非基因組轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”,與膜受體結(jié)合后可以快速引發(fā)一系列的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。這些快速效應(yīng)通常數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘便可產(chǎn)生,無法用經(jīng)典的基因組轉(zhuǎn)錄學(xué)說來解釋,我們稱之為雌激素的快速效應(yīng),或非基因組轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。研究已經(jīng)證實,雌激素可激活子宮內(nèi)膜癌細胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞的生長。雌激素是否可激活子宮內(nèi)膜癌細胞絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖,國內(nèi)鮮見報道。P2

3、1ras蛋白是由原癌基因ras編碼的分子量為21KD的膜結(jié)合型表達蛋白,也是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要成員。P-ERK是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的活性形式,ERK是MAPK家族中的一類脯氨酸導(dǎo)向的絲/蘇氨酸蛋白激酶,正常定位于胞漿,激活后形成P-ERK,轉(zhuǎn)位至胞核,產(chǎn)生細胞效應(yīng)。其可磷酸化轉(zhuǎn)錄因子,啟動一些即早基因的表達如c-jun和c-fos等,誘導(dǎo)cy

4、clinD1和c-myc等癌基因表達,cyclin D1的表達促使細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致細胞惡性增殖。此外,P-ERK還可以上調(diào)cyclinE的表達,并滅活細胞周期抑制蛋白P27KIP,從多個水平調(diào)節(jié)細胞凋亡,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此,本課題以雌激素受體陽性的Ishikawa和雌激素受體低表達的HEC-1A細胞為研究對象,研究了雌激素對P21ras和P-ERK的活化及對細胞增殖、周期的影響,初步探討了雌激素通過“非基因組轉(zhuǎn)錄效

5、應(yīng)”對MAPK通路活化,從而為子宮內(nèi)膜癌的治療提供理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　1、材料:人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa來源于人子宮內(nèi)膜高分化腺癌,雌激素受體(ER)陽性,HEC-1A來源于美國ATCC細胞庫,ER低表達,均由北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科實驗室魏麗惠教授惠贈。細胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),均貼壁生長,根據(jù)細胞生長狀態(tài)每1~3天換液或傳代。
　　2、方法:(

6、1)運用MTT法檢測不同濃度的E2(空白對照,10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L和10-4mol/L)作用于Ishikawa和HEC-1A細胞不同時間(24h,48h,72h)后細胞的吸光度值的變化。
　　(2)應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測不同濃度的E2(空白對照,10-8mol/L和10-6mol/L)作用于Ishikawa和HEC-1A細胞相同時間24h后細胞的增殖周期的改變。
　　(3)應(yīng)用免疫細胞化

7、學(xué)檢測子宮內(nèi)膜癌細胞中P21ras和P-ERK的活性,觀察濃度為10-6mol/L的E2分別作用于2種細胞不同時間(空白對照,5min,15min,30min,1h,2h)后,得出最佳活化時間;不同濃度的E2(空白對照,10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L和10-4mol/L)分別作用于2種細胞的最佳時間,分析P21ras和P-ERK的時間效應(yīng),濃度效應(yīng),兩者之間的相關(guān)性及與ER的關(guān)系。
　　3、采用SPS

8、S13.0軟件統(tǒng)計,細胞吸光度值和細胞周期的結(jié)果用單因素方差分析,P21ras和P-ERK比較用t或t’檢驗,P21ras和P-ERK與ER的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、隨著E2濃度增加,Ishikawa細胞的增殖活性呈時間依賴性(F≥32.93,P≤0.001),細胞周期中G0-G1期比例下降(F=54.552,P≤0.001),S期比例升高(F=40.88,P=0.000)

9、;HEC-1A細胞的增殖活性及細胞周期各期比例變化不顯著(p均＞0.05)。
　　2、檢測P21ras和P-ERK的活化水平中,10-6mol/L的E2作用于Ishikawa細胞30min時P21ras和P-ERK的活化最顯著(74.00±2.5495,68.00±4.8166),作用于HEC-1A細胞15min時,P21ras和P-ERK即有明顯激活而且達到高峰(78.00±3.1623,74.00±2.3022)。隨著E2濃度

10、增加2種細胞中P21ras和P-ERK表達均逐漸增加,呈濃度依賴性的特點。
　　3、不同時間,不同濃度E2作用下,2種子宮內(nèi)膜癌細胞中P21ras和P-ERK之間均呈正相關(guān)(r≥0.049,p≤0.027,r≥0.047,p≤0.036),P21ras,P-ERK兩種蛋白在ER(+)的Ishikawa和ER低表達的HEC-1A細胞中的表達均呈負相關(guān)(r≤-0.049,p≤0.030,r≤-0.048,p≤0.032)。
　　

11、結(jié)論:1.E2可以促進子宮內(nèi)膜癌Ishikawa(ER+)細胞增殖和周期的進展,而對ER低表達的HEC-1A細胞增殖作用不顯著,可能是由與兩種細胞內(nèi)ER水平不同,在ER(+)的Ishikawa細胞,E2可以通過轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄兩種機制來影響細胞的增殖狀態(tài)和周期進展,而在HEC-1A細胞,E2僅能通過非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)一種機制來產(chǎn)生效應(yīng)。
　　2.E2可以迅速促進子宮內(nèi)膜癌細胞中P21ras和P-ERK的活化,并呈濃度依賴性且兩種蛋白表達之間呈