SQSTM1-p62增強食管鱗癌細胞凋亡抗性的作用機制研究.pdf

1、食管癌是消化系統(tǒng)的常見腫瘤，嚴重危害人類的身體健康。尋找其有效的基因靶點抑制腫瘤的生長并進行深入的功能研究，對于提高食管癌患者生存率和改善食管癌治療具有重要的意義。實驗室前期在研究食管癌抗凋亡基因PKCiota時發(fā)現(xiàn)，SQSTM1/p62表達受PKCiota影響，并且臨床食管癌組織標本檢測顯示p62與PKCiota的蛋白表達正相關。p62是一個多功能的泛素化接頭蛋白，在自噬調(diào)控、多條細胞信號通路以及腫瘤中發(fā)揮重要作用。目前p62在食管癌

2、中的功能及作用機制均未有報道，為此我們對其進行了深入的研究。
　　我們首先利用免疫熒光細胞化學技術分析了食管癌細胞系KYSE150、KYSE180、KYSE510、KYSE450、Eca-109和COLO-680N中p62的表達水平及亞細胞定位情況，結(jié)果顯示p62在COLO-680N細胞中表達較低，但在其它食管癌細胞系中均表達較高并定位于胞漿。隨后我們選取KYSE450和KYSE180食管癌細胞系進行體外功能實驗。采用敲降p62對

3、細胞表型進行研究，發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)的條件下，改變p62蛋白表達不影響細胞增殖、凋亡、集落形成能力和細胞周期等表型;但經(jīng)過無血清培養(yǎng)12h后，p62蛋白水平降低能明顯促進食管癌細胞凋亡并抑制細胞集落形成能力。動物實驗結(jié)果顯示，p62蛋白表達降低可抑制裸鼠皮下瘤生長。
　　基于在無血清培養(yǎng)狀態(tài)下，p62促進食管癌細胞抗凋亡能力和細胞生存活力，我們對p62影響其細胞表型相關的分子機制進行了探究。在無血清培養(yǎng)條件下敲降p62，Western

4、 blot檢測發(fā)現(xiàn)S期激酶相關蛋白(SKP2)的蛋白水平下調(diào)，同時采用RT-PCR和Real-Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)SKP2的mRNA水平也降低。饑餓處理狀態(tài)下敲降SKP2可增加食管癌細胞凋亡水平。進一步研究表明p62通過調(diào)節(jié)PKCiota蛋白表達而影響SKP2蛋白水平。利用免疫共沉淀(Co-IP)檢測發(fā)現(xiàn)，p62與PKCiota相互結(jié)合。加入泛素化蛋白酶體抑制劑(MG132)作用24h后發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)條件下敲降p62組中SKP2

5、蛋白水平有一定的回升，免疫沉淀(IP)實驗檢測發(fā)現(xiàn)與SKP2相連的多聚泛素化(Ub)蛋白水平明顯增加。
　　隨后我們構建了三個不同的p62結(jié)構域缺失突變體，檢測對食管癌細胞表型的影響。結(jié)果顯示p62的PB1結(jié)構域具有一定的生物活性，其缺失可明顯降低食管癌細胞生存活力，同時在分子水平上證明p62結(jié)構中PB1結(jié)構域缺失可引起PKCiota蛋白水平的下調(diào)。
　　我們利用PKCiota抑制劑Aurothiomalate(ATM)處理

6、食管癌細胞系，發(fā)現(xiàn)對細胞增殖和凋亡均沒有明顯的作用。但當p62-siRNA和ATM聯(lián)合應用，發(fā)現(xiàn)可以明顯促進食管癌細胞凋亡、抑制細胞生存活力和細胞增殖;同時在分子水平上分析發(fā)現(xiàn)，p62-siRNA和ATM聯(lián)合處理組中p62、PKCiota和SKP2的蛋白水平均顯著降低。
　　綜上所述，p62通過PB1結(jié)構域與PKCiota相互作用，抑制SKP2蛋白泛素化降解，從而提高食管癌細胞抗凋亡能力和細胞生存活力。本研究的結(jié)果綜合提示，p62