電離輻射誘導食管鱗癌細胞發(fā)生EMT增加轉移潛能和放療抗性的分子機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　食管癌是全球威脅人類生命和健康的最常見惡性腫瘤之一，我國每年食管癌發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病總人數(shù)的一半以上，以食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)最為常見。放射治療作為食管癌的主要治療手段之一，但食管癌常規(guī)放療療效較差，5年生存率不超過10％。局部復發(fā)轉移是中晚期食管癌放射治療失敗的主要原因，而關于放療后食管癌局部復發(fā)和轉移的機制尚不清楚。
　　上皮間質轉

2、化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞失去上皮細胞特征和極性同時獲得間質樣表型及侵襲潛能的現(xiàn)象。EMT不僅在腫瘤侵襲和轉移中發(fā)揮著關鍵性的作用，而且EMT與腫瘤細胞耐藥、腫瘤干細胞形成密切相關。
　　研究表明電離輻射(Ionizing Radiation，IR)誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT，增加腫瘤細胞轉移能力。關于IR誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT的機制，目前尚不完全清楚。關于IR誘導腫瘤

3、細胞發(fā)生EMT是否與腫瘤獲得性放療抵抗有關，國內外尚無文獻報道。
　　本課題深入研究IR誘導食管鱗癌細胞發(fā)生EMT增加轉移潛能和放療抗性的作用及機制，尋找關鍵作用靶點，以期通過逆轉EMT來減少放療后局部復發(fā)和轉移風險，為提高放療療效提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.觀察IR后食管鱗癌Eca109、Te1細胞和放療抵抗細胞Eca109R的形態(tài);采用免疫熒光檢測IR后Eca109和Te1細胞EMT標志蛋白的表達

4、;采用Real Time PCR、Western blot檢測IR后Eca109、Te1細胞和Eca109R EMT標志物mRNA和蛋白的表達;采用免疫組化法檢測IR后Eca109裸鼠移植瘤EMT標志蛋白的表達;采用劃痕實驗和Transwell移動侵襲實驗檢測IR后Eca109和Te1細胞侵襲遷移能力;采用平板克隆形成實驗檢測5Gy X-ray照射后的Eca109細胞和Eca109R細胞放療敏感性。
　　2.采用ELISA法檢測I

5、R后食管鱗癌Eca109、Te1細胞分泌的IL-6的含量;采用Real Time PCR和Western blot檢測IR后Eca109和Te1細胞IL-6/Stat3/Twist通路mRNA和蛋白的表達;采用Real Time PCR和Western blot檢測放療抵抗細胞Eca109R EMT關鍵轉錄因子TwistmRNA和蛋白的表達。
　　3.收集30例新輔助放療食管鱗癌病人放療前后手術標本，采用免疫組化法檢測放療前后腫瘤

6、組織中EMT標志蛋白和IL-6/Stat3/Twist通路蛋白的表達，分析放療前后表達的差異。
　　4.使用Jak2特異性阻斷劑AG490和sh-Twist阻斷IL-6/Stat3/Twist通路;采用Western blot檢測IR聯(lián)合AG490和sh-Twist后Eca109和Te1細胞EMT標志蛋白和Stat3/p-Stat3/Twist通路蛋白的表達;采用免疫組化法檢測IR聯(lián)合AG490和sh-Twist后食管鱗癌Eca1

7、09裸鼠移植瘤EMT標志蛋白的表達;采用劃痕實驗和Transwell移動侵襲實驗檢測IR聯(lián)合AG490和sh-Twist后Eca109和Te1細胞侵襲遷移能力。
　　5.采用RNA干擾技術沉默食管鱗癌放療抵抗株Eca109R中EMT關鍵轉錄因子Twist的表達;采用Real Time PCR和Western blot檢測Eca109R EMT標志和關鍵轉錄因子Twist mRNA和蛋白的表達;采用平板克隆形成實驗檢測Eca109R

8、細胞放療敏感性。
　　6.采用MTT檢測sh-Twist聯(lián)合IR后Eca109R細胞的存活率;采用流式細胞儀檢測細胞凋亡;建立Eca109R細胞裸鼠移植瘤模型，觀察移植瘤生長;TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡。采用Western blot檢測Eca109R細胞Akt通路及相關凋亡蛋白的表達。
　　結果:
　　1.IR后的食管癌鱗癌Eca109、Te1細胞和放療抵抗細胞Eca109R形態(tài)由圓形橢圓形變?yōu)樗笮渭忓N形;與未放療

9、組比較，IR后的Eca109、Te1細胞和Eca109R上皮標志蛋白E-cadherin的表達顯著減少，間質標志蛋白N-cadherin和Vimentin的表達顯著增多;與未放療組比較，10Gy放療后Eca109裸鼠移植瘤E-cadherin的表達減低，N-cadherin和Vimentin的表達顯著增高;與未放療組比較，IR后的Eca109、Te1細胞侵襲遷移能力增加;與未放療組比較，5Gy X-ray照射后的Eca109細胞和Eca

10、109R細胞放療抗性顯著增加。
　　2.與未放療組比較，IR后食管鱗癌Eca109、Te1細胞分泌的IL-6顯著增加;與未放療組比較，IR后食管鱗癌Eca109、Te1細胞IL-6/Stat3/Twist通路mRNA和蛋白的表達上調;與未放療組比較，放療抵抗細胞Eca109R EMT關鍵轉錄因子Twist mRNA和蛋白的表達升高。
　　3.新輔助放療食管鱗癌病人放療前后腫瘤組織中EMT標志蛋白和IL-6/Stat3/Twi

11、st通路蛋白的表達有顯著差異。與放療前比較，新輔助放療后食管鱗癌組織中高表達E-cadherin的病例數(shù)比例減小，高表達N-cadherin和Vimentin的病例數(shù)比例增大，高表達IL-6/Stat3/Twist通路蛋白的病例數(shù)比例增大。
　　4.與單純放療組比較，聯(lián)合AG490和sh-twist組食管鱗癌Eca109、Te1細胞上皮標志蛋白E-cadherin的表達顯著增高，間質標志蛋白N-cadherin和Vimentin表

12、達顯著降低，p-Stat3和Twist蛋白表達顯著降低;與單純放療組比較，聯(lián)合AG490和sh-twist組食管鱗癌Eca109裸鼠移植瘤E-cadherin表達顯著增高，N-cadherin和Vimentin表達顯著降低;與單純放療組比較，聯(lián)合AG490和sh-twist組食管鱗癌Eca109、Te1細胞侵襲遷移能力降低。
　　5.與Eca109R/sh-NC組比較，Eca109R/sh-twist組細胞上皮標志蛋白E-cadh

13、erin表達顯著增高，間質標志蛋白N-cadherin和Vimentin表達顯著降低;與Eca109R/sh-NC組比較，Eca109R/sh-twist組放療后細胞克隆形成率降低，放療敏感性增加。
　　6.與Eca109R/sh-NC組比較，Eca109R/sh-twist組放療后細胞存活率降低，細胞凋亡率增加，移植瘤生長減慢，移植瘤組織凋亡細胞增多;與Eca109R/sh-NC組比較，Eca109R/sh-twist組細胞p-

14、Akt和抗凋亡蛋白表達下調，凋亡蛋白表達上調。
　　結論:
　　1.IR誘導食管鱗癌細胞發(fā)生EMT增加轉移潛能和放療抗性。
　　2.IR激活IL-6/Stat3/Twist通路促進食管癌細胞發(fā)生EMT。
　　3.新輔助放療激活食管鱗癌組織IL-6/Stat3/Twist通路促進EMT。
　　4.阻斷IL-6/Stat3/Twist通路逆轉IR誘導的食管鱗癌細胞EMT和轉移潛能獲得。
　　5.沉默Twi