食管鱗癌高表達(dá)趨化因子鑒定及T細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)研究.pdf

1、目的
　　食管癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性消化道腫瘤之一，是威脅人類生存的一大殺手，盡管近年來隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，治療食管癌的手段有所提高，但是患者5年生存率仍低于20％。文獻(xiàn)報(bào)道，T細(xì)胞亞群歸巢到腫瘤部位的能力與患者預(yù)后相關(guān);CD8+T細(xì)胞在清除外來物質(zhì)和腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，其歸巢能力與患者預(yù)后正相關(guān)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞歸巢到腫瘤部位則抑制殺傷性T細(xì)胞功能，其歸巢能力與患者預(yù)后負(fù)相關(guān)。研究報(bào)道顯示，惡性黑色素瘤患者體內(nèi)趨化因子通過

2、與其受體相互作用，在T細(xì)胞歸巢過程中發(fā)揮重要作用。但是尚未揭示T細(xì)胞在食管癌患者體內(nèi)的歸巢機(jī)制，探討T細(xì)胞亞群歸巢至食管癌組織的分子機(jī)制將會(huì)對(duì)改進(jìn)CIK療法提供重要理論依據(jù)。本研究以食管癌患者標(biāo)本為研究對(duì)象，探討在腫瘤部位高表達(dá)趨化因子，并對(duì)腫瘤部位高表達(dá)趨化因子與浸潤T細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析;檢測(cè)高表達(dá)趨化因子相應(yīng)受體在食管癌患者外周血和組織浸潤性淋巴細(xì)胞中所占比例，并探討這些高表達(dá)趨化因子的主要來源;體外驗(yàn)證趨化因子對(duì)T細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的影

3、響。CIK療法是新興免疫療法，在取得一定臨床效果的同時(shí)少數(shù)患者對(duì)該療法呈無應(yīng)答狀態(tài)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明CIK細(xì)胞歸巢能力可能是決定其臨床療效的重要因素之一。探討T細(xì)胞歸巢過程的分子機(jī)制將會(huì)對(duì)改進(jìn)CIK臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法
　　鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集食管癌患者標(biāo)本。采用RT-PCR法檢測(cè)趨化因子CCL2/CCL4/CCL5/CCL8/CCL11/CCL17/CCL20/CCL21/CCL22/CXCL10/CXCL12

4、在食管癌組織和癌旁組織表達(dá);此外還檢測(cè)食管癌組織中T細(xì)胞表型markerCD4/CD8/FoxP3和功能因子IL-10/Perforin/GranzymeB在基因水平的表達(dá)。免疫組化技術(shù)檢測(cè)食管癌組織高表達(dá)趨化因子并分析其主要分泌來源。使用密度梯度離心法，F(xiàn)icoll-Plaque淋巴細(xì)胞分離液分離提取食管癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)和腫瘤組織中浸潤性T細(xì)胞(tumor

5、infiltratinglymphocytes，TIL)，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群及高表達(dá)趨化因子相應(yīng)受體在外周血單個(gè)核細(xì)胞和腫瘤浸潤性T細(xì)胞中比例。新鮮分離獲得的食管癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，先采用磁分選技術(shù)純化富集T細(xì)胞，然后體外使用Transwell技術(shù)檢測(cè)趨化因子對(duì)T細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響。
　　結(jié)果
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示，趨化因子CCL4/CCL20/CXCL10在食管癌組織中

6、的表達(dá)高于癌旁部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而趨化因子CCL2/CCL5/CCL8/CCL11/CCL17/CCL21/CCL22/CXCL12表達(dá)在腫瘤組織和癌旁組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與之相一致，免疫組化結(jié)果顯示CCL4/CCL20/CXCL10在癌組織高表達(dá)，且腫瘤細(xì)胞是趨化因子的主要來源。
　　2.相關(guān)性分析結(jié)果顯示，食管癌組織中，趨化因子CCL4和CXCL10均與CD8/Perforin/GranzymeB的表達(dá)正相關(guān)，而趨化因

7、子CCL20與CD4/FoxP3以及抑制性因子IL-10的表達(dá)正相關(guān)。
　　3.流式結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞在食管癌腫瘤浸潤性T細(xì)胞所占比例高于外周血單個(gè)核細(xì)胞;總CD4+T細(xì)胞在腫瘤浸潤性T細(xì)胞中所占比例低于外周血單個(gè)核細(xì)胞但是CD4+Foxp3+T細(xì)胞亞群在腫瘤浸潤性T細(xì)胞積聚;與基因結(jié)果相一致，腫瘤浸潤性T細(xì)胞中趨化因子受體CCR5和CXCR3在CD8+T細(xì)胞上所占比例高于外周血單個(gè)核細(xì)胞而CCR6+CD4+Foxp3+T細(xì)

8、胞比例在腫瘤浸潤性T細(xì)胞中大大升高。
　　4.體外Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人工合成的趨化因子CCL4，CCL20和CXCL10均增強(qiáng)T細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力;收集下室細(xì)胞，流式分析結(jié)果顯示，CCL4和CXCL10主要招募CD8+T細(xì)胞而CCL20主要招募CD4+Foxp3+T細(xì)胞亞群。
　　結(jié)論
　　趨化因子CCLA/CCL20/CXCL10在食管鱗癌患者腫瘤組織中高表達(dá)，分別影響了表達(dá)相應(yīng)受體的CD8+T和CD4+