細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記法鑒定食管鱗癌蛋白差異表達(dá)譜.pdf

1、背景：
　　 食管癌（Esophageal cancer，EC）是世界上六大常見的惡性腫瘤之一。食管癌的發(fā)病具有明顯的地區(qū)差異，河南太行山區(qū)的林州市及其毗鄰的輝縣、安陽(yáng)等地區(qū)是世界及我國(guó)EC發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一，目前仍是該地區(qū)腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。
　　 目前，對(duì)食管原位癌和粘膜內(nèi)癌的早期食管癌患者，內(nèi)鏡下粘膜內(nèi)切除術(shù)后五年生存率可分別達(dá)到100％和95％；早期食管癌經(jīng)外科切除后，5年和10年生存率分別為9

2、0％和75％[1]。然而，大多數(shù)病人在臨床上確診之后的生存時(shí)間不超過(guò)一年，死亡率非常高，五年生存率僅為8％，60-70％的病例死于全身播散和轉(zhuǎn)移，主要是由于就診病人幾乎全部是中晚期患者。提高食管癌治療效果的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，然而目前尚無(wú)早期診斷和預(yù)警的有效措施。因此，闡明食管癌的發(fā)病因素及多階段演進(jìn)分子機(jī)制，篩選和鑒定與食管癌變密切相關(guān)的預(yù)警分子，找尋新的治療靶點(diǎn)和更有效的治療方法，確定高危人群監(jiān)測(cè)和食管癌早期診斷的

3、高特異性、高敏感性生物標(biāo)志物，具有十分重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 定量蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代研究熱點(diǎn)之一[2]，不但成為疾病診斷、預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的探索、鑒定的重要工具，更增進(jìn)了對(duì)生命過(guò)程及疾病發(fā)生分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)與理解。二維電泳和穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白或肽段是定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的兩種技術(shù)手段。我們前期研究應(yīng)用二維電泳（Two-dimensional electrophoresis,2-DE）對(duì)食管上皮永生化細(xì)胞和癌細(xì)

4、胞、及河南食管癌高發(fā)區(qū)林州市的食管癌及癌旁組織進(jìn)行研究，已發(fā)現(xiàn)三十多種與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白。然而,2-DE 本身還存在著技術(shù)缺陷，如對(duì)分子量過(guò)大或過(guò)小、酸性或堿性、難溶的蛋白質(zhì)檢出敏感性較低，并且低通量、耗時(shí)長(zhǎng)、難以精確定量和自動(dòng)化等。
　　 目前穩(wěn)定同位素標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜定量分析方法發(fā)展迅速。細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記（Cell culture and stable isotope labeling，SILAC）是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程

5、中利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析的一種新技術(shù)，SILAC 不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，還可精確定量，具有樣本需求量少、操作簡(jiǎn)單、直接、高效等特點(diǎn)[3]。
　　 因此，穩(wěn)定同位素標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜定量分析正在逐步取代2-DE[4]。本研究采用SILAC 技術(shù)分別培養(yǎng)標(biāo)記食管上皮永生化細(xì)胞（重型穩(wěn)定同位素[U-13C6]-H-Lysine和[U-13C6]-H-Arginine）和食管癌細(xì)胞（輕型穩(wěn)定同位素[

6、12C6]-L-Lysine和[12C6]-L-Arginine），待細(xì)胞標(biāo)記完全后，細(xì)胞裂解提取蛋白，分別從各食管永生化細(xì)胞（NE3、NE6和NEC）和食管癌細(xì)胞（EC1、EC109和EC9706）取等量總蛋白，制備食管永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞的混合蛋白樣本，經(jīng)SDS－PAGE分離，根據(jù)膠中蛋白含量將膠分為48 份，膠內(nèi)胰酶消化并洗脫酶解肽混合物，高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（Highperformance liquid chromatogra

7、phy-electrosprayI onization-mass sepectrometry,HPLC-ESI-MS/MS）定量分析永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞蛋白差異表達(dá)譜，確定與食管癌形成、發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子。
　　 目的：
　　 本研究通過(guò)采用SILAC和HPLC-ESI-MS/MS定量分析確立與食管癌變相關(guān)的差異蛋白表達(dá)譜，篩選候選關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子，探討其生物學(xué)意義，豐富食管癌變的分子理論，為食管癌高危人群

8、篩查、早期診斷、治療監(jiān)測(cè)提供更多的候選分子，旨在達(dá)到降低食管癌發(fā)病率和死亡率，改善預(yù)后。
　　 方法：
　　 1.食管上皮永生化細(xì)胞NE3、NEC、NE6 培養(yǎng)條件由角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（Keratinocyte serum free medium，KSFM）培養(yǎng)逐步適應(yīng)RPMI1640 培養(yǎng)條件；
　　 2.分別利用包含重型穩(wěn)定同位素[U-13C6]-H-Lysine和[U-13C6]-H-Arginine

9、和輕型穩(wěn)定同位素[12C6]-L-Lysine和[12C6]-L-Arginine的培養(yǎng)基SILAC-RPMI1640 雙重培養(yǎng)標(biāo)記永生化細(xì)胞NEC、NE3、NE6和食管癌細(xì)胞EC1、EC109、EC9706；
　　 3.混合蛋白制備及SDS-PAGE分離，膠內(nèi)胰酶消化蛋白為肽段，HPLC-ESI-MS/MS 檢測(cè)定量分析，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢、生物信息學(xué)等方法確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子名稱；
　　 4.候選關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)分子

10、判定標(biāo)準(zhǔn)：差異倍數(shù)大于1.5，HPLC-ESI-MS/MS 鑒定到2個(gè)以上特異肽段，并且變異系數(shù)小于50％；
　　 5.免疫印跡方法（Western blot，WB）驗(yàn)證關(guān)鍵候選蛋白分子MIF 在食管永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞系及分泌上清中的表達(dá)變化；
　　 6.免疫組織化學(xué)方法（Immunohistochemistry，IHC）確立MIF 在活檢的食管正常粘膜及癌前病變粘膜和手術(shù)標(biāo)本的各臨床分期食管癌組織中的變化特征；7.酶聯(lián)

11、免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)MIF 在食管癌患者血清和非癌對(duì)照病人中的表達(dá)特征。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過(guò)SILAC 標(biāo)記、質(zhì)譜、生物信息學(xué)等方法，在食管永生化及癌細(xì)胞中共鑒定到1790種蛋白。其中差異倍數(shù)1.5倍以上，HPLC-ESI-MS/MS 鑒定到2個(gè)以上特異肽段，變異系數(shù)小于50％的差異蛋白分子共有43個(gè)；這些蛋白參與細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的多個(gè)生

12、物學(xué)過(guò)程，分屬多個(gè)家族：如骨架蛋白、蛋白抑制劑家族成員、氧化還原類蛋白、分子伴侶、細(xì)胞因子、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝、能量代謝及酶代謝相關(guān)的蛋白等；
　　 2.Western blot 驗(yàn)證了MIF 在食管癌組織、癌細(xì)胞系中的高表達(dá)；
　　 3.IHC 確定了MIF 在食管癌前病變和中晚期食管癌組織中表達(dá)顯著增高（p<0.05）；
　　 4.ELISA分析結(jié)果表明，食管癌患者血清中MIF表達(dá)升高，并且食管癌晚期患者血

13、清中MIF表達(dá)進(jìn)一步升高（p=0.076）。
　　 結(jié)論：
　　 1.SILAC 標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)用HPLC-ESI-MS/MS 可定量比較分析、鑒定與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異蛋白表達(dá)譜；
　　 2.本研究共鑒定出與食管癌變相關(guān)的關(guān)鍵候選差異蛋白分子共43種；
　　 3.MIF 可能是食管癌變多階段演進(jìn)過(guò)程中的重要變化分子之一，提示MIF 一方面可能是食管癌高危人群篩查、早期診斷及療效評(píng)估的候選分子標(biāo)志物，另