蛋白質(zhì)拼接法制備片段同位素標(biāo)記ApoE及RAP結(jié)構(gòu)的初步研究.pdf

1、ApoE是一種阿樸質(zhì)蛋白，它有299個氨基酸。它可以同LDL受體蛋白、肝素以及磷酯相結(jié)合，其主要的生理功能是調(diào)節(jié)體內(nèi)磷酯的代謝。它同第三類高酯血、動脈硬化及老年癡呆病相關(guān)。了解apoE的結(jié)構(gòu)以及其在體內(nèi)的分子生物學(xué)過程，可提高人類對這些疾病的預(yù)防以及治療的水平。ApoE氨基端(1—199)的結(jié)構(gòu)已用X-Ray法進(jìn)行了測定，而apoE羧酸端及整個分子的結(jié)構(gòu)依然未知。由于apoE蛋白質(zhì)分子量較大，NMR信號重疊較多，不利于結(jié)構(gòu)的解析以及片段

2、相互作用的研究。我們擬利用INTEIN媒介蛋白質(zhì)拼接方法，制備部分同位素標(biāo)記的apoE，降低NMR結(jié)構(gòu)解析的難度。受體相關(guān)蛋白(RAP)是一種LDL受體折疊的伴侶蛋白，它由323個氨基酸組成，同apoE一樣，可以同LDL受體蛋白結(jié)合，兩者之間有一定的相似性。本文著重研究了利用INTEIN媒介蛋白質(zhì)拼接法制備apoE，并對RAP及各片段性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究。 ㈠在使用蛋白質(zhì)拼接法制備部分同位素標(biāo)記apoE的過程中，詳細(xì)研究了相關(guān)蛋

3、白的制備及拼接反應(yīng)的條件，產(chǎn)物的純化。在制備羧酸端的過程中，使用三種不同的方法：直接法制備，使用CNBr切斷法以及凝血因子Xa酶切方法，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)凝血因子Xa酶切法無論時收率還是穩(wěn)定性方面均較成功，但該方法的缺點是存在非特異性的酶切位點；在對apoE氨基端研究過程中，發(fā)現(xiàn)使用堿性的培養(yǎng)介質(zhì)可提高蛋白質(zhì)的表達(dá)收率，使用簡單含巰基的化合物進(jìn)行硫醇解后所得產(chǎn)物會發(fā)生水解，無法用于下步的反應(yīng)；在比較了不同的蛋白質(zhì)拼接方法后，發(fā)現(xiàn)使用INTEIN

4、媒介的蛋白質(zhì)拼接法可以得到較好的效果；使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，第一次大量地制備了部分片段同位素標(biāo)記的apoE，并進(jìn)行了NMR測定，得到了簡化了的NMR譜圖。為進(jìn)一步使用NMR研究apoE的結(jié)構(gòu)提供了可能。本方法對于制備其它部分同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)有借鑒意義。 ㈡針對在使用pTYB1表達(dá)載體表達(dá)蛋白質(zhì)的過程中出現(xiàn)的自裂解現(xiàn)象，進(jìn)行了比較分析，有針對性提出的解決方案。所得到的兩種變異體可以部分或幾乎完全禁阻自裂解。所使用的方法具有通用性