基于同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)核因子-κB必需分子結(jié)合的小分子多肽改善腫瘤壞死因子-α抑制成骨細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、骨的代謝及形成障礙大部分是由感染他等因素造成的炎癥反應(yīng)直接干擾，而炎癥反復(fù)影響，長期存在。在中國，每年骨折患者約有5000萬例，其中骨折不愈合的發(fā)病率約為5％-10％，主要因?yàn)楣钦蹆?nèi)固定術(shù)后或開放性骨折術(shù)后繼發(fā)感染或其它因素引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)的導(dǎo)致。骨折的愈合過程，即壞死骨碎片溶解加上骨基質(zhì)大量形成、礦化的過程。其過程主要包括成骨細(xì)胞的成骨和破骨細(xì)胞的溶骨。兩者的作用相互拮抗制約，達(dá)到一定的動(dòng)態(tài)平衡。一般情況下，創(chuàng)傷骨折或骨病中的炎癥反

2、應(yīng)能刺激機(jī)體啟動(dòng)生理功能，抵抗并排除損害因素，修復(fù)損傷的骨組織，促進(jìn)骨折的愈合。但是組織長期過度地受炎性損害，機(jī)體難以形成骨質(zhì)，甚至遭受骨質(zhì)的進(jìn)一步破壞溶解。近些年來，越來越多的科學(xué)家開始研究有關(guān)炎性因子與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的關(guān)系，其中慢性持續(xù)性的炎癥可加快骨吸收過程的相關(guān)研究已較為成熟。然而在另一方面，慢性持續(xù)性的炎癥對成骨細(xì)胞的代謝的作用尤其是對成骨細(xì)胞分化相關(guān)的研究尚未成熟，其相互作用與具體機(jī)制至今未明確。成骨細(xì)胞分化涉及多條

3、細(xì)胞信號(hào)通道轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，某些通路之間存在相互交談(cross talk)、相互影響，在炎癥刺激下其調(diào)節(jié)過程更為復(fù)雜精細(xì)，即使研究某一條或多條通路也難以明確成骨細(xì)胞在炎癥刺激下的形成及分化過程。在未來的生物醫(yī)學(xué)研究里，從多個(gè)炎癥發(fā)展階段、多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)和控制炎癥才是骨再生研究的發(fā)展方向。通過深入研究炎癥對成骨細(xì)胞分化的影響及其相關(guān)干預(yù)機(jī)制，并在炎癥通路下找出特異性的可控靶點(diǎn)，才能多層次多靶點(diǎn)的控制炎癥，促進(jìn)成骨分化，實(shí)現(xiàn)抗炎、

4、促成骨的新藥物的開發(fā)。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的成熟導(dǎo)致后基因組時(shí)代的到來，蛋白質(zhì)是生物功能更直接的執(zhí)行者，成為現(xiàn)今生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定義是:對機(jī)體、組織或細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、功能及它們之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行高通量的篩選和定量定性分析，比以往通過單個(gè)基因、蛋白來研究疾病的診療更加可靠，機(jī)體狀態(tài)的反映更準(zhǔn)確。
　　運(yùn)用傳統(tǒng)的生化技術(shù)，如基于雙向凝膠電泳分析-質(zhì)譜鑒定技術(shù)，逐個(gè)地去研究大量的蛋白質(zhì)，

5、篩查檢測的工作量龐大而難以完成，更別說從中發(fā)現(xiàn)新的發(fā)病機(jī)制。iTRAQ技術(shù)比起傳統(tǒng)的技術(shù)如2-DE，具有更高通量和高靈敏度的分析能力，運(yùn)用在比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有突出的優(yōu)勢。
　　通過比較機(jī)體在健康和炎癥狀態(tài)下的成骨分化的蛋白質(zhì)表達(dá)的差異變化，能獲得大量候選標(biāo)志物蛋白。然而，這些大量候選標(biāo)志物蛋白與疾病的發(fā)生發(fā)展過程的更明確的關(guān)系及其特異性檢測驗(yàn)證是目前研究生物標(biāo)志物工作的一大難題。基于質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple Rea

6、ction Monitoring，MRM)技術(shù)驗(yàn)證和檢測進(jìn)行生物標(biāo)志物，可以通過高靈敏度質(zhì)譜技術(shù)挑選出目標(biāo)蛋白。該技術(shù)并不需進(jìn)行合成特異性抗體，因此比起RT-PCR和Western-blot等需要抗體檢測的技術(shù)，其更具有優(yōu)勢。使用不同水平的驗(yàn)證技術(shù)研究，驗(yàn)證基于iTRAQ技術(shù)NBD多肽改善TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定結(jié)果是否可靠，能明確進(jìn)一步研究的可行性，同時(shí)也能更全面地認(rèn)識(shí)炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化機(jī)制及差異標(biāo)記物蛋白的

7、功能性質(zhì)，為后續(xù)標(biāo)志物的驗(yàn)證、功能驗(yàn)證建立基礎(chǔ)，所以非常必要。
　　本實(shí)驗(yàn)研究包括三部分內(nèi)容:
　　第一章 NBD多肽改善TNF-α抑制成骨分化模型建立及驗(yàn)證
　　C2C12細(xì)胞經(jīng)BMP-2誘導(dǎo)進(jìn)行成骨分化，炎癥刺激物TNF-α抑制C2C12肌原細(xì)胞的成骨分化，NBD多肽在炎癥刺激影響成骨分化過程中抑制炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)完成后將進(jìn)行組織化學(xué)染色檢測ALP活性及ALP熒光定量分析以此來驗(yàn)證模型的有效性。以此作為下一

8、步iTRAQ技術(shù)的蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)分析建立基礎(chǔ)。
　　第二章基于iTRAQ技術(shù)NBD多肽改善TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　本部分研究擬使用上一章節(jié)中以TNF-α作為炎癥刺激物、NBD多肽作為炎癥抑制劑作用在BMP2誘導(dǎo)的肌原前體C2C12細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的模型，將采用iTRAQ化學(xué)標(biāo)簽分別標(biāo)記炎癥刺激組、NBD多肽作用組和正常分化組中細(xì)胞分離出的蛋白樣品，使用多維液相色譜分離-串聯(lián)質(zhì)譜來鑒定，從而篩選出潛在的

9、可能與炎癥刺激與炎癥受抑制下成骨細(xì)胞分化過程相關(guān)的差異性蛋白。
　　第三章 NBD多肽改善TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化相關(guān)的差異蛋白的MRM表達(dá)驗(yàn)證
　　本部分研究采用基于質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）技術(shù)分析差異蛋白，為NBD多肽在改善TNF-α對成骨分化抑制的作用機(jī)制的進(jìn)一步研究及差異蛋白的篩查提供依據(jù)。
　　材料方法:
　　1.細(xì)胞模型的建立:實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來自小鼠肌源細(xì)胞株C2C12。將其分為3組，加入不同刺激物繼續(xù)

10、培養(yǎng)。①B組，即BMP組，在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BMP-2，濃度為100 ng/ml;②BT組，即BMP+TNF組，在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)加入BMP-2和TNF-α，BMP-2濃度為100 ng/ml，TNF-α濃度則是5 ng/ml;③BTP組，即BMP+TNF+NBD多肽組。經(jīng)過堿性磷酸酶(ALP)熒光活性測定及染色測定:檢測C2C12成骨分化的情況。將其以5×103個(gè)/孔比例接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)。3天后進(jìn)行ALP活性用熒光檢測

11、試劑盒檢測，采用PNPP法測定其ALP的活性，選擇波長405 nm，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度值，記錄結(jié)果。培養(yǎng)的第7天進(jìn)行染色實(shí)驗(yàn)，按照Alkaline Phosphatase Staining Kit操作說明書進(jìn)行。
　　2.采用iTRAQ技術(shù)及生物信息學(xué)分析篩選差異蛋白:細(xì)胞的蛋白質(zhì)經(jīng)過抽提及定量，使用iTRAQ試劑對其標(biāo)記及檢測。然后進(jìn)行預(yù)備LC/MS/MS分析、強(qiáng)陽離子(SCX)交換，再經(jīng)過反相液相色譜分離、ESI

12、質(zhì)譜鑒定。最后對分析數(shù)據(jù)，檢索和鑒定蛋白，篩選出差異蛋白。
　　2.1.差異蛋白生物信息學(xué)分析:對差異蛋白進(jìn)行GO分析、COG注釋、GO富集以及Pathway顯著性分析，以此來研究差異蛋白密切相關(guān)的主要生物功能、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　3.MRM:選擇目標(biāo)蛋白Transition篩選后在MRM+EPI模式下驗(yàn)證transition的色譜峰，再經(jīng)過MRM檢測其子離子的峰強(qiáng)度，整合計(jì)算離子峰面積，最后比較不同樣本中的目標(biāo)蛋

13、白表達(dá)豐度。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（版本13.0）處理數(shù)據(jù)。采用單向方差分析比較多組均數(shù)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，若方差齊采用LSD法，方差不齊時(shí)則采用Kruskal-Wallis法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.ALP染色測定結(jié)果結(jié)果顯示:B組呈現(xiàn)藍(lán)色顆粒分布;BT組與B組相比，其細(xì)胞培養(yǎng)孔里呈現(xiàn)出的藍(lán)色顆粒較弱，表明BT組的ALP活性明顯降低;BTP組的藍(lán)色顆粒分布比BT組增加。ALP

14、熒光活性測定結(jié)果3組成骨細(xì)胞的成骨分化活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=225.80，P=0.00)。各組進(jìn)行多重比較，BT組比B組成骨細(xì)胞的成骨分化活性降低(P＜0.05)，提示TNF-α抑制BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化;BTP組相比起B(yǎng)T組，成骨活性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　2.iTRAQ試劑標(biāo)記3組C2C12肌原細(xì)胞(BMP-2，TNF-α，BMP-2+TNF-α+NBD)，根據(jù)篩選LC MS/MS鑒定分析結(jié)果，B組與BT組(

15、b_B_114-VS-e_BT_118)兩組達(dá)到定量標(biāo)準(zhǔn)（比值≥1.5或≤0.6）的蛋白76個(gè)，其中BT組中上調(diào)的蛋白質(zhì)有59個(gè)，BT組中下調(diào)的蛋白質(zhì)有17個(gè)。BT組與BTP組(b_BT_118-VS-f_BTP_119)兩組定量標(biāo)準(zhǔn)（比值≥1.5或≤0.6）的蛋白數(shù)有43個(gè)，其中BTP組中上調(diào)的蛋白質(zhì)有25個(gè)，BTP組中下調(diào)的蛋白質(zhì)有18個(gè)。NPC1蛋白共鑒定出3張譜圖，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析后均為NPC1蛋白。對B VS BT組間差異蛋白

16、與BT VS BTP組間差異蛋白做交集處理，篩選得到8表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，即1）Periostin,2)SERCA3B,3)Scaf1,4)Actn2,5)Atp5d,6)Elp2,7)Atp51及8)Npc1。
　　3.通過MRM檢測目標(biāo)蛋白子離子的峰強(qiáng)度，整合計(jì)算離子峰面積的大小，從而可以比較目標(biāo)蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異。成骨分化受到炎癥刺激受抑制是，表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)為Elp2，Atp5d。其中Elp2上升幅度最大;表達(dá)下調(diào)的

17、為Actn2，Atp51及Npc1，Atp2a3(SERCA3B);當(dāng)加入NBD多肽改善炎癥反應(yīng)，Elp2，Atp5d出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，其余蛋白質(zhì)趨向水平化。
　　結(jié)論：
　　1.NBD多肽改善TNF-α抑制BMP-2誘導(dǎo)的C2C12肌源細(xì)胞成骨分化實(shí)驗(yàn)可認(rèn)為改善炎癥抑制成骨分化模型，經(jīng)驗(yàn)證有效。
　　2.iTRAQ技術(shù)及生物信息學(xué)分析篩選得到8個(gè)炎癥刺激成骨細(xì)胞分化過程中差異蛋白，即Periostin，SERCA3B，S