親環(huán)蛋白A的制備、表征及協(xié)助蛋白質(zhì)重折疊初步研究.pdf

1、親環(huán)蛋白A(CypA)具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性，可以催化Xaa-Pro肽鍵的順反異構(gòu)，并促進(jìn)以脯氨酸肽鍵異構(gòu)為限速步驟的體內(nèi)外蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)，協(xié)助蛋白質(zhì)正確三維結(jié)構(gòu)的形成。進(jìn)行CypA協(xié)助蛋白質(zhì)體外重折疊的研究對解讀“第二遺傳密碼”以及指導(dǎo)基因工程包涵體蛋白的重折疊復(fù)性具有重要的理論與現(xiàn)實意義。 首先在大腸桿菌中成功轉(zhuǎn)化了攜帶CypA表達(dá)基因的質(zhì)粒，并對重組菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了考察。通過培養(yǎng)溫度與搖床轉(zhuǎn)速的控

2、制實現(xiàn)了重組CypA的胞內(nèi)可溶表達(dá)。進(jìn)一步優(yōu)化了培養(yǎng)基組成及操作條件，確定優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，甘露醇10 g/L，Amp 20 mg/L，pn 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為200 mL/500 mL，接種量為10％。在對數(shù)生長期中期OD<,600>為1.3時加入1 mM的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后在30℃、180 rpm的條件下繼續(xù)培養(yǎng)9 h收獲菌體。優(yōu)化后每升發(fā)酵液目標(biāo)蛋白產(chǎn)量為

3、66.7 mg。將發(fā)酵液離心后，對細(xì)胞進(jìn)行破碎，取破胞后的上清通過離子交換層析進(jìn)一步純化，蛋白回收率為35.5％，活力回收率可達(dá)82.4％，最終每升發(fā)酵液可得到電泳純CypA蛋白54.9mg。 其次對制備的CypA突變株進(jìn)行了表征，重點考察了Pro16/Ser16取代在CypA結(jié)構(gòu)與功能中的作用，包括肽質(zhì)量指紋圖譜、PPIase活力測定、環(huán)孢菌素CsA對CypA的抑制作用、變性曲線以及CypA重折疊等多種方法。實驗測定CypA

4、催化模型底物的K<,cat/>K<,m>值為1.5×10<'6> M<'-1>S<'-1>，是野生型CypA的十分之一。測得IC<,50>為26.5 nM，與野生型基本一致。利用Erying圖譜考察了肽鍵順反異構(gòu)的一些熱力學(xué)性質(zhì)。通過變性曲線測定發(fā)現(xiàn)CypA突變株對鹽酸胍高度敏感，且對脲的穩(wěn)定性下降。考察了CypA突變株的重折疊性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其具有自催化特性。通過一系列結(jié)構(gòu)與功能的測定，表明Pro16/Ser16取代在CypA結(jié)構(gòu)與功能中具

5、有重要作用。 最后，初步考察了CypA在核糖核酸酶A(RNase A)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)體外重折疊中的應(yīng)用。CypA可以對RNase A的折疊動力學(xué)產(chǎn)生較大影響，其折疊過程中的慢相反應(yīng)由CypA催化加快。CypA在G-CSF重折疊中的作用較為復(fù)雜，RP-HPLC結(jié)果顯示CypA對G-CSF的正確折疊有一定的協(xié)助作用，這種作用可能是CypA的PPIase活性間接促進(jìn)了二硫鍵的形成，并且分子伴侶活性在這一過程中也發(fā)