基于乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記—液相色譜—傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組研究策略的建立、評價與應(yīng)用.pdf

1、本研究目的是開發(fā)一整套具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記和液質(zhì)聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)定量新策略，實現(xiàn)高通量，高準(zhǔn)確性，高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，用來克服商業(yè)化試劑存在的不足，擺脫對于商業(yè)化標(biāo)記試劑的依賴性。 首先建立和優(yōu)化了一種針對肽段還原性氨基的乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法。該方法經(jīng)條件優(yōu)化后具有以下優(yōu)點：乙酰化穩(wěn)定同位素試劑用量少，副反應(yīng)少，能標(biāo)記樣品中全部蛋白質(zhì)或肽段，標(biāo)記后的蛋白質(zhì)或肽段的質(zhì)量差可以預(yù)測，標(biāo)記方法簡單，標(biāo)記過

2、程反應(yīng)條件溫和，標(biāo)記基團(tuán)在多維色譜分離條件中穩(wěn)定，標(biāo)記基團(tuán)在質(zhì)譜分析中穩(wěn)定，不會產(chǎn)生額外的碎片離子，標(biāo)記方法能夠應(yīng)用于包括人體在內(nèi)的所有生物樣本并且試劑廉價易得。但是單純的乙?；瘶?biāo)記方法標(biāo)記位點是還原性的氨基端，每個肽段至少標(biāo)記上一個乙?；鶊F(tuán)(即至少摻入3個氘原子)，盡管氘原子數(shù)量的增加可以避免標(biāo)記肽段間同位素峰重疊問題，但是隨著摻入的氘原子數(shù)量的增加而引起的反相色譜中的同位素效應(yīng)也會增加。為了減少由于同位素效應(yīng)引起的標(biāo)記肽段色譜保留時

3、間滯后，從而造成質(zhì)譜分析的誤差，構(gòu)建了基于納升級反相色譜分離、在線點靶和MAIDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀聯(lián)用的定量策略。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物的定量實驗驗證，表明該策略完全可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析，具有實際應(yīng)用價值。在規(guī)模化蛋白質(zhì)鑒定分析中，電噴霧離子源(ESI)質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析電離源(MAIDI)質(zhì)譜相比，前者使用更為廣泛。因此，為了能夠?qū)⒁阴；瘶?biāo)記方法與在線色譜分離和納升級電噴霧離子源的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀聯(lián)用，同時提

4、高乙?；瘶?biāo)記方法的質(zhì)譜檢測靈敏度，本研究又發(fā)展了一種胍基化修飾乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法。該方法除了具有上述乙?；瘶?biāo)記方法的優(yōu)點之外，由于胍基化修飾的乙?；臉?biāo)記方法保證了每個肽段只會被一個乙酰基所標(biāo)記(即只有3個氘原子的摻入)，因此很好的控制了氫氘同位素試劑在反相色譜中的同位素效應(yīng)，同時提高了標(biāo)記肽段在質(zhì)譜中的靈敏度。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物體系的定量分析實驗，表明該策略定量分析準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)。 在胍基化修飾的乙?；瘶?biāo)記方法建立的

5、基礎(chǔ)上，根據(jù)標(biāo)記方法和所使用的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集的特點，自主開發(fā)了一套自動化數(shù)據(jù)定量分析軟件MSAQ，用于規(guī)?；亩坑嬎?。 為了進(jìn)一步評價本研究中建立的基于胍基化修飾的乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記，液相色譜一傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組策略在生物樣本中應(yīng)用的可行性，將該策略在三種不同的復(fù)雜生物樣本體系中進(jìn)行了實際應(yīng)用，獲得了滿意的結(jié)果。 將該策略應(yīng)用于大腸桿菌N

6、末端肽組學(xué)研究中。在整體蛋白質(zhì)水平胍基化后的氫代氘代乙酰化標(biāo)記，既提高了肽段在質(zhì)譜中檢測靈敏度，又實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)N末端肽的特異性同位素標(biāo)記，因而易于從一級質(zhì)譜圖中識別N末端肽同時進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜測序分析。77種大腸桿菌蛋白質(zhì)的N-末端序列被確定，其中46種蛋白質(zhì)N-末端序列信息和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫完全一致，另外31種蛋白質(zhì)的甲硫氨酸是否去除的信息在數(shù)據(jù)庫中沒有詳細(xì)注釋，而通過我們實驗對該31種蛋白質(zhì)甲硫氨酸是否去除進(jìn)行了精確測定，另

7、外確證了9種蛋白質(zhì)的N末端是以信號肽去除的方式存在。 實驗結(jié)果表明，本研究建立的定量蛋白質(zhì)組策略不僅能對蛋白質(zhì)的N末端進(jìn)行規(guī)模化的特異性識別和測序，還能對N末端的翻譯后修飾(如甲酰甲硫氨酸和信號肽去除問題)進(jìn)行精確測定。該策略與傳統(tǒng)的Edman降解具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和通量化的優(yōu)點，因而在蛋白質(zhì)N末端測序領(lǐng)域有著更加廣泛的應(yīng)用前景。其次，將該策略應(yīng)用于代謝蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。對由四氯化碳(CCl<,4>)造成的大鼠肝損傷組織CY

8、P450蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行了定量研究，17種CYP450蛋白質(zhì)被定量分析，其中2E1的表達(dá)量顯著下調(diào)，該結(jié)果驗證了由于2E1介導(dǎo)的CCl4的代謝產(chǎn)生活潑的自由基，從而導(dǎo)致2E1蛋白比之其他CYP450蛋白質(zhì)更容易受到CCl<,4>毒理性的影響的論斷。同時除了2E1表達(dá)量顯著變化外，其他幾種CYP450蛋白質(zhì)表達(dá)量同時也發(fā)生了顯著性的變化，說明本研究中所使用的規(guī)?；亩糠治鍪侄危粌H可以對于已有研究結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，同時還可以揭示其他CYP4

9、50蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。 最后，將該策略應(yīng)用于血漿定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。血漿蛋白質(zhì)組成與細(xì)胞、組織與器官的生理病理狀態(tài)密切相關(guān)。由于血漿蛋白質(zhì)含量動態(tài)范圍非常寬(>10<'12>)，因而，如果能夠?qū)ρ獫{蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量化、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的定量分析，是對本研究中所建立的整套定量分析策略最好的評價。 (1)對正常血漿樣本進(jìn)行了1：1標(biāo)記實驗，結(jié)果顯示理論值和實驗值的誤差小于5％。 (2)對處于肝炎不同階段的血漿樣本

10、進(jìn)行了定量研究，總共對1025種血漿蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析，其中具有2倍以上顯著性差異的蛋白質(zhì)有185種。包括了在血漿中濃度只有20ng/ml的Heparin cofactor 2 precursor，和濃度小于10pg/ml Angiotensinogen precursor，該結(jié)果表明本標(biāo)記方法實現(xiàn)了動態(tài)范圍達(dá)9個數(shù)量級的血漿蛋白質(zhì)定量分析(albumin，35mg/mL-Angiotensinogenprecursor,<10pg/

11、mL)(3)為了進(jìn)一步驗證定量結(jié)果的可靠性，對其中一種差異顯著的蛋白質(zhì)Fibronectin進(jìn)行了western驗證。分析顯示western定量結(jié)果和質(zhì)譜定量結(jié)果一致。 綜上所述，本研究建立的基于胍基化乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記，液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和自主開發(fā)的定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)新策略，既能夠?qū)碜杂谠松锏臉颖具M(jìn)行分析，又能夠?qū)碜哉婧松锏臉颖具M(jìn)行分析，既能夠分析組織樣本又能夠分析體液樣本。