色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)分析鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、為探索蛋白質(zhì)組學(xué)研究中3種不同方法鑒定蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確性、可靠性及簡(jiǎn)便性和蛋白質(zhì)序列的手工解析法在蛋白質(zhì)化學(xué)中的應(yīng)用,利用高效液相色譜(RP-HPLC)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)分別分析模式蛋白分子(牛血清白蛋白,BSA)及合成多肽粗產(chǎn)物.在此基礎(chǔ)上,并以小鼠肝臟為材料經(jīng)SDS-PAGE分離后用聯(lián)用技術(shù)分析其膜蛋白質(zhì)組.通過(guò)聯(lián)用技術(shù)直接對(duì)模式蛋白分子的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離和測(cè)定,從而獲得系列BSA酶解片段的一級(jí)(MS

2、)和二級(jí)(MS/MS)質(zhì)譜數(shù)據(jù),經(jīng)分析軟件處理后,分別通過(guò)不同處理和不同參數(shù)設(shè)置,用3種不同方法通過(guò)網(wǎng)上蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)搜尋鑒定.結(jié)果證明,粗產(chǎn)物中的主成分即為目標(biāo)十三肽,另外幾個(gè)主要副產(chǎn)物為十三肽的殘缺肽或氧化肽.對(duì)色譜和生物質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析合成多肽的意義和副產(chǎn)物形成的可能機(jī)制進(jìn)行了討論.最后以小鼠肝臟為材料,運(yùn)用亞細(xì)胞分離技術(shù)(蔗糖密度梯度離心)分級(jí)分離質(zhì)膜,再用兩性離子去垢劑(CHAPS)、非離子去垢劑(NP-40)和離液劑

3、(chaotropes 如硫脲、尿素等)組合,綜合處理細(xì)胞質(zhì)膜得到膜蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分離、考馬斯亮蘭染色、膠內(nèi)原位酶解,再通過(guò)毛細(xì)管高效液相色譜(capLC)和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)進(jìn)行色譜分離與質(zhì)譜鑒定,得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件運(yùn)用MASCOT軟件分析.結(jié)果鑒定了512個(gè)蛋白,其中有91個(gè)蛋白重復(fù)出現(xiàn)在不同條帶上(共重復(fù)135次),所以實(shí)際鑒定出377種不同(NCBI中g(shù)i號(hào)不同)蛋白質(zhì).其中膜蛋白有88種,包括內(nèi)膜蛋