多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)器官之一，是人體物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換及供應(yīng)的中心，在人體的生命活動(dòng)中占有重要地位；同時(shí)，肝臟也是常見(jiàn)的病原體持續(xù)感染的場(chǎng)所，因此，對(duì)肝臟蛋白質(zhì)組的研究有助于人們對(duì)肝臟正常生理功能以及肝臟疾病機(jī)制的深入了解。本文主要是以多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為研究平臺(tái)，以肝臟組織為研究對(duì)象，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一些基本問(wèn)題：如生物樣品的分離，質(zhì)譜鑒定的重現(xiàn)性，低豐度蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)，鑒定結(jié)果的可信度以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的充分挖掘與利用等方面作

2、系統(tǒng)的研究，為進(jìn)一步的規(guī)?；鞍踪|(zhì)學(xué)研究提供參考。 蛋白質(zhì)組學(xué)的基本目標(biāo)是盡可能的鑒定到生物體所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和完善，高通量地分析生物體的蛋白質(zhì)組成已經(jīng)成為可能。但是生物樣品的高度復(fù)雜性嚴(yán)重干擾了蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定。因此有必要對(duì)生物樣品進(jìn)行預(yù)分離以簡(jiǎn)化樣品組成。在第二章中，搭建和優(yōu)化了液相色譜質(zhì)譜平臺(tái)，從蛋白質(zhì)水平和蛋白的酶切肽段水平分別對(duì)生物樣品進(jìn)行預(yù)分離。在蛋白質(zhì)水平，我們優(yōu)化了反相色譜(RPLC)對(duì)復(fù)雜

3、生物樣品的分離效果。在肽段水平，搭建了離線的SCX-RPLC兩維液相色譜體系。我們利用建立的多維液相色譜質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)，采取重復(fù)多次運(yùn)行策略構(gòu)建了目前世界上規(guī)模最大的人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。通過(guò)6次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，共獲得了6,000,000余張二級(jí)質(zhì)譜圖，通過(guò)SEOUEST軟件對(duì)人類(lèi)蛋白質(zhì)IPI3.07數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，在90％的可信度水平下共鑒定到35658個(gè)去冗余肽段，用Buildsummary軟件合并后，共得到13150個(gè)去冗余蛋白質(zhì)(或

4、蛋白質(zhì)Group)，其中雙肽段以上匹配蛋白質(zhì)為7001個(gè)。 對(duì)雙肽段匹配蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、功能及亞細(xì)胞定位進(jìn)行了全面分析，說(shuō)明重復(fù)“Shotgun”策略是一種高通量、高靈敏度的蛋白質(zhì)組研究策略。同時(shí)我們也分析了蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測(cè)頻次與蛋白質(zhì)豐度之間的關(guān)系，通過(guò)重復(fù)的ESI-RPLC-MS/MS技術(shù)可以鑒定更多的低豐度蛋白質(zhì)。另外，相同的蛋白質(zhì)在不同批次中被鑒定也起到相互印證的作用，從而增加鑒定結(jié)果的可信度。在規(guī)?；鞍踪|(zhì)組學(xué)研究中

5、，鑒定結(jié)果的可靠性越來(lái)越受到人們的關(guān)注。在第三章中，應(yīng)用全新的LTQ-FTICR質(zhì)譜儀器，對(duì)質(zhì)量準(zhǔn)確度對(duì)鑒定結(jié)果可信度的影響進(jìn)行了研究。質(zhì)譜儀器的質(zhì)量準(zhǔn)確度是質(zhì)譜儀器的關(guān)鍵參數(shù)，在蛋白質(zhì)的定性分析中起重要作用，對(duì)LTO，F(xiàn)T-full(全掃描模式)及FT-SIM(選擇離子監(jiān)控模式)三種質(zhì)譜采集模式下的分辨率，質(zhì)譜掃描時(shí)間，質(zhì)量準(zhǔn)確度進(jìn)行了考察，分析了不同質(zhì)量準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫(kù)檢索中可信度過(guò)濾參數(shù)的變化，高質(zhì)量準(zhǔn)確度條件下鑒定肽段的del

6、taCn值普遍升高，Xcorr值下降。研究表明，鑒定結(jié)果的可信度與質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量準(zhǔn)確度和母離子質(zhì)量誤差設(shè)置密切相關(guān)。對(duì)FT的數(shù)據(jù)進(jìn)行了Sequest和Mascot算法的比較，肽段和蛋白的重疊率均在70％以上。這兩種軟件均可用于FT數(shù)據(jù)的檢索，但mascot對(duì)質(zhì)量準(zhǔn)確度更為敏感?；谝陨戏治觯@得了一組高可信度、高質(zhì)量準(zhǔn)確度的中國(guó)人健康肝臟蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集(4898個(gè)蛋白質(zhì)，2640個(gè)蛋白質(zhì)Group)。 質(zhì)譜數(shù)據(jù)中蘊(yùn)藏著豐富的信息

7、，對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的充分挖掘是當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究的難點(diǎn)。SNPs是人類(lèi)基因組中最為常見(jiàn)的一種遺傳多態(tài)性，具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，它與生物個(gè)體差異和許多疾病直接相關(guān)，是決定人類(lèi)疾病易感性和藥物反應(yīng)差異的主要因素。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)SNP的發(fā)掘和鑒定一直是以基因水平的分析為基礎(chǔ)的。在第四章中，首次提出了一套完整的基于液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜數(shù)據(jù)的肽段nsSNP位點(diǎn)發(fā)掘的策略和技術(shù)路線。利用構(gòu)建的肽庫(kù)，對(duì)先前的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新解析，發(fā)現(xiàn)了一系列由于nsS

8、NP導(dǎo)致的氨基酸突變的肽段和蛋白質(zhì)，從而在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了這些SNP的存在。 在前期工作中，發(fā)現(xiàn)生物樣品中蛋白質(zhì)的豐度確實(shí)與該蛋白質(zhì)的酶解肽段被質(zhì)譜儀檢測(cè)到的頻率有關(guān)系。在第五章中，基于建立的液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)，利用相對(duì)簡(jiǎn)單的酵母體系建立了根據(jù)差異樣品中共同鑒定蛋白質(zhì)的肽段檢測(cè)頻率的比值來(lái)發(fā)現(xiàn)差異蛋白尋找生物標(biāo)志物的方法，并對(duì)不同歸一化方法進(jìn)行了比較分析，并將建立的非標(biāo)定量方法成功地應(yīng)用于肝癌細(xì)胞模型HepG2和HepG2-HBx細(xì)胞