蛋白質(zhì)組學(xué)中的多維液相色譜—質(zhì)譜技術(shù)研究及其在胰腺癌標志物篩選中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)中繼基因組計劃之后最為活躍的熱點研究領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵在于蛋白質(zhì)的分離和鑒定。二維凝膠電泳是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)，但其存在著諸多難以克服的缺陷；多維液相色譜以其分離效率高、方法靈活多樣，且容易實現(xiàn)自動化的特點，受到越來越多的研究者的重視，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中逐漸擴大了應(yīng)用范圍。本研究利用離線多維液相色譜聯(lián)用，對人血清和組織蛋白質(zhì)進行了分離并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-ass

2、istedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MADLI-TOFMS)進行檢測鑒定；將其應(yīng)用于胰腺癌腫瘤標志物的篩選研究中，取得了比較滿意的效果。 本論文主要包括以下五個部分： 1.前言部分。簡述了蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究中的分離、生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)、生物信息學(xué)以及差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究等內(nèi)容；介紹了胰腺癌的研究進展以及本研究的主要內(nèi)容和意義。

3、2.體積排阻—反相色譜—質(zhì)譜(SEC-RPLC-MS)對血清蛋白質(zhì)組的研究。首先將血清樣品使用緩沖溶液稀釋、脲溶液變性和疏水色譜餅預(yù)分離三種方式進行預(yù)處理，并對預(yù)處理的條件作了優(yōu)化和比較。預(yù)處理后的樣品通過體積排阻(sizeexclusionchromatography,SEC)和反相色譜(reversephasechromatography,RPLC)離線聯(lián)用分離后，使用MADLI-TOFMS對各個組分進行檢測。結(jié)果表明選擇濃度為5.

4、0mol·L-1的脲溶液進行變性，有效降低了血清中高豐度蛋白對低豐度蛋白的影響。采用疏水色譜餅對血清進行預(yù)分離，提高了樣品處理量，有利于低豐度蛋白的富集和分離。同時研究中以肌紅蛋白為模型使用質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定，方法穩(wěn)定，結(jié)果準確。 3.親合色譜—反相色譜—質(zhì)譜(AFC-RPLC-MS)對血清糖蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。建立了使用AFC-RPLC分離和質(zhì)譜檢測研究人血清中糖蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)平臺。通過兩種不同方法對硅膠進行化學(xué)改性后，

5、鍵合伴刀豆球蛋白(concanavalinA，ConA)，制備了親合色譜柱。使用該親合色譜(affinitychoromatography，AFC)柱對標準糖蛋白RNaseB進行了分離純化，并對分離條件作了優(yōu)化。用糖肽酶PNGaseF和胰蛋白酶對RNaseB進行酶切后，再使用ConA親合柱分離出糖肽和多糖，結(jié)合使用質(zhì)譜源后衰變技術(shù)，對糖蛋白的糖含量、糖蛋白的氨基酸序列、糖基化位點及糖連接方式作了研究。利用親合色譜對血清中的糖蛋白和酶解后

6、的糖肽進行了分離，結(jié)果表明該方法可用于血清中N-連接甘露糖型糖蛋白研究，并可以推廣用于糖蛋白質(zhì)組的研究。 4.胰腺組織的多維液相色譜質(zhì)譜研究。使用離子交換色譜(ionexchangechromatography,IEC)對樣品進行預(yù)分離，再用SEC-RPLC分離并用MALDI-TOFMS檢測，共檢出300余種不同質(zhì)荷比的蛋白/多肽分子。該方法靈活簡便，可作為組織樣品蛋白質(zhì)組研究的通用型方法。 5.胰腺癌標志物的篩選研

7、究。在前述方法基礎(chǔ)上，通過對健康人血清和胰腺癌術(shù)前、術(shù)后患者血清進行多維色譜分離和MALDI-TOFMS檢測，并以胰旁系癌患者血清檢測結(jié)果作為對照，篩選出兩種顯著差異蛋白分子。其中分子量為5734D的蛋白質(zhì)/多肽在胰腺癌患者血清中呈現(xiàn)明顯上調(diào)，陽性檢出率為76.19％，特異性達到80.77％。，分子量為5923D的蛋白質(zhì)/多肽在胰腺癌患者血清中呈現(xiàn)下調(diào)，敏感性達為73.33％。對胰腺癌患者及健康人血清中糖蛋白進行了差異篩選，同樣找出了分