分泌蛋白質(zhì)組研究及其在肝細胞癌標志物發(fā)現(xiàn)中的應用.pdf

1、分泌蛋白參與機體免疫、凝血與抗凝血、物質(zhì)運輸、營養(yǎng)、細胞或組織之間通訊以及生長信號調(diào)節(jié)等多種重要的生理過程，是新的治療方法和藥物靶點的豐富資源。血漿蛋白質(zhì)絕大部分由細胞或組織合成，經(jīng)過信號肽剪切、糖基化、磷酸化等翻譯后修飾加工之后分泌到血漿中，因此從某種意義上來講，血漿蛋白質(zhì)組涵蓋了分泌蛋白質(zhì)組的內(nèi)容。這里我們應用多維色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術分析了肝細胞分泌蛋白質(zhì)組，并且用可剪切型同位素標記的親和標簽技術(Cleavable Isotop

2、e-Coded Affinity Tags，cICAT)分析了AFP陽性肝癌細胞株HepG2和AFP陰性正常肝細胞株Chang liver分泌蛋白質(zhì)組之間的差異。我們總共鑒定了1778種人類蛋白質(zhì)，并成功地發(fā)現(xiàn)81種蛋白質(zhì)在它們之間存在著2倍以上的差異變化，其中31種蛋白質(zhì)在肝癌細胞HepG2分泌物中表達量增高。我們對這31個蛋白質(zhì)進行文獻查詢驗證，發(fā)現(xiàn)12個蛋白質(zhì)在以往的文獻報道中同樣在肝細胞癌(HCC)中表達量增高，例如AFP,載

3、脂蛋白E和玻連蛋白等；8個蛋白質(zhì)在以往的文獻報道中在其它癌癥中表達量增高，例如補體C3和鋅α2糖蛋白等；僅1個蛋白質(zhì)在以往的文獻報道中在其它癌癥中低表達。這些不僅說明了從癌癥分泌蛋白質(zhì)組中尋找腫瘤標志物策略的優(yōu)越性，同時也說明了通過cICAT技術比較分析腫瘤分泌蛋白質(zhì)組來尋找癌癥標志物的結(jié)果的可靠性和正確性。 隨后，我們用細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標記氨基酸的方法(Stable Isotope Labeling with Amino

4、 acids in Cell culture，SILAC)結(jié)合優(yōu)化的非標記定量技術(Label-free Quantitative Technique，LFQ)分析了肝癌細胞株HepG2和正常肝細胞株L02分泌物之間的差異。以傳統(tǒng)的2倍差異為閾值，我們用LFQ分析3對不同實驗中得到的同一組分(1:1)時，發(fā)現(xiàn)假陽性率為2.9％±0.7％。LFQ在兩次重復的實驗中定量得到的蛋白質(zhì)以及得到的蛋白質(zhì)的相對定量比值之間的重復性都相當高。在兩次重

5、復的實驗中有83％的蛋白質(zhì)被共同定量到，并且這些蛋白質(zhì)的相對定量比值之間具有很強的相關性(PEARSON相關系數(shù)等于0.97)，兩次實驗得到的蛋白質(zhì)相對定量比值之間的相對比率為1.02±0.45。與SILAC方法相比較，LFQ具有相同或者稍好的重復性。當?shù)鞍踪|(zhì)在相對定量雙方的豐度均較大時，LFQ能夠分析小于2倍的表達變化差異，具有更高的靈敏度。另外，SILAC方法和LFQ技術共同定量到的蛋白質(zhì)的相對定量比值，它們之間也具有很強的相關性(

6、PEARSON相關系數(shù)等于0.92)，說明非標記定量技術得到的蛋白質(zhì)相對定量比值同樣具有良好的可靠性?？偠灾?，非標記定量方法并不亞于其它蛋白質(zhì)組定量方法如cICAT和SILAC，能夠精確和高通量地分析肝癌細胞分泌蛋白質(zhì)組，從中找到有價值的診斷和預后的血清學標志物。我們結(jié)合SILAC和LFQ方法總共得到了299個蛋白質(zhì)在HepG2和LO2分泌蛋白質(zhì)組中存在著兩倍以上的表達差異。其中121個差異表達蛋白質(zhì)的定量信息(≥2倍)至少在三次差異

7、定量分析中得到驗證。結(jié)合前面從HepG2和Chang差異分泌蛋白質(zhì)組中得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，我們通過免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗驗證了載脂蛋白E、α1酸性糖蛋白1／2、AFP、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-7、TIMP-1和TIMP-2這幾個表達差異蛋白質(zhì)在肝癌患者血清和正常人血清之間的表達變化，有待成為有應用價值的肝標志物。 另外，我們用固相pH梯度等電聚焦蛋白質(zhì)預分級和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術分析了人類血漿的蛋白質(zhì)組成和特性。

8、隨后，我們以HepG2和LO2同位素標簽的分泌物為中介分析了肝癌血漿和正常人血漿之間的蛋白質(zhì)表達差異，成功地得到300個血漿蛋白的定量信息。其中86種蛋白質(zhì)在肝癌患者血漿中表達量增高如AFP和載脂蛋白A-I等，60種蛋白質(zhì)在肝癌患者血漿中表達量降低如E1泛素激活酶和FK506結(jié)合蛋白4等。這些結(jié)果說明用同位素標簽分泌蛋白質(zhì)組做中介分析肝癌患者血漿跟正常人血漿之間的差異具有一定的可行性。 隨著蛋白質(zhì)組學技術的迅速發(fā)展和不斷完善，利