基于蛋白質(zhì)組學策略的膿毒癥生物標志物研究.pdf

1、膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，是重癥監(jiān)護病房(ICU)常見的死亡原因之一。膿毒癥的發(fā)病機制非常復雜且尚不明確，涉及患者復雜的原發(fā)病、復雜的病原體感染、復雜的毒力因子、復雜的宿主基因組多態(tài)性和機體反應(yīng)性、復雜的多系統(tǒng)相互作用網(wǎng)絡(luò)等。膿毒癥這種復雜性和非線性的特點為我們診斷膿毒癥和預(yù)測其預(yù)后帶來嚴重困難，也是導致其病死率居高不下的主要原因。

2、近年來，不少學者致力于膿毒癥生物標志物(sepsis biomarker)研究，試圖發(fā)現(xiàn)某些可以提示膿毒癥存在與否及其嚴重程度、揭示其發(fā)病機制、區(qū)分各種微生物感染以及全身炎癥反應(yīng)和局部感染的生物標志物，以促進膿毒癥的診斷、預(yù)測和新的防治方法的研發(fā)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)超過200個生物標志物與膿毒癥的診斷或預(yù)后預(yù)測有關(guān)，但其敏感性和特異性不高，單個生物標志物對膿毒癥的診斷、預(yù)后預(yù)測效果并不理想。目前，尚無理想的生物標志物用于膿毒癥的臨床診斷或

3、預(yù)后預(yù)測。因此，采用現(xiàn)代科學技術(shù)，發(fā)現(xiàn)更多新的、可靠的生物標志物以提高膿毒癥的診斷、預(yù)后預(yù)測及防治水平具有重要的科學意義。
　　本研究擬采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)的方法來制備大鼠膿毒癥模型，并根據(jù)死亡時間將實驗大鼠分為四組:假手術(shù)組、CLP24h死亡組、CLP48h死亡組和CLP存活組。各組大鼠于CLP術(shù)后12h通過心臟穿刺取血2-2.5ml，血液凝固后經(jīng)離心獲得血清。血清去高豐度蛋白后用iTRAQTM試劑進行標記，通過二維液相色

4、譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定假手術(shù)對照組、膿毒癥存活組、24h死亡組和48h死亡組血清蛋白質(zhì)組的變化。采用ELISA技術(shù)對各差異表達蛋白進行進一步驗證，從中篩選出新的生物標志物，采用Logistic回歸分析方法建立膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測的數(shù)學模型。同時，從發(fā)現(xiàn)的生物標志物中挑選正五聚蛋白(PTX3)用于臨床膿毒癥患者的診斷和預(yù)后預(yù)測研究，并將其結(jié)果與傳統(tǒng)的生物標志物降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白（CRP）進行對比，評估其在膿毒癥患者診斷和預(yù)后判斷中的潛

5、在意義。實驗結(jié)果如下:
　　運用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學方法，從膿毒癥大鼠血清中共鑒定出162個蛋白質(zhì)。其中在膿毒癥大鼠和假手術(shù)組大鼠血清中發(fā)現(xiàn)47個差異表達蛋白。與假手術(shù)組相比，膿毒癥大鼠血清中有31個蛋白質(zhì)表達升高，16個蛋白質(zhì)表達降低。在膿毒癥死亡組與存活組大鼠血清中篩選出28個差異表達蛋白。與膿毒癥大鼠存活組相比，死亡組血清中有14個蛋白質(zhì)表達升高，14個蛋白質(zhì)表達降低。
　　為進一步驗證iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學的分

6、析結(jié)果，我們采用ELISA方法從上述實驗所發(fā)現(xiàn)的膿毒癥差異表達蛋白中選出25個蛋白進一步做定量檢測，發(fā)現(xiàn)其中21個蛋白質(zhì)的ELISA結(jié)果和iTRAQ結(jié)果保持一致。為篩選出對膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測最有價值的生物標志物，我們對膿毒癥大鼠和假手術(shù)組大鼠血清中25個差異表達蛋白的ELISA結(jié)果進行了Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)PTX3、MMRN1、FCN1、CPN2、PRSS1和PF4是與膿毒癥診斷密切相關(guān)的生物標志物，根據(jù)這六個生物標志物得出

7、六個膿毒癥診斷相關(guān)的方程為:Logit P=1.473 PTX3-37.054; Logit P=4.118 MMNR1-39.249; Logit P=0.053 FCN1-52.381; Logit P=0.074 CPN2-21.569; Logit P=9.967 PF4-6.520; Logit P=0.039 PRSS1-4.227。該六個模型在大鼠膿毒癥診斷中的敏感性、特異性和準確度均達到100％。同時，我們將膿毒癥死亡組

8、和存活組大鼠血清中25個差異表達蛋白的ELISA結(jié)果進行了Logistic回歸分析，得到了一個與膿毒癥預(yù)后預(yù)測相關(guān)的模型:Logit P=-179.688+0.794 MMRN1+1.682 PPBP-0.003 FGα-0.011 FGβ。采用該模型對膿毒癥大鼠的預(yù)后進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其敏感性為100％，特異性為91.7％。上述研究揭示了一批潛在的新的膿毒癥生物標志物，為膿毒癥的臨床診斷和預(yù)后預(yù)測提供了新的思路和實驗線索。
　　3、

9、為評估PTX3在膿毒癥患者診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用，我們從ICU選擇一批膿毒癥病人進行了臨床研究，并將PTX3與傳統(tǒng)的膿毒癥生物標志物降鈣素原(PCT)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)進行了比較。結(jié)果顯示，與SIRS組相比，膿毒癥組血清PTX3、CRP和PCT濃度均升高(P＜0.05);與膿毒癥存活組相比，死亡組的血清PTX3濃度進一步升高(P＜0.05)，而血清CRP和PCT濃度升高沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。血清PTX3、CRP、PCT濃

10、度和APACHEⅡ評分的ROC曲線分析顯示，與傳統(tǒng)的生物標志物CRP、PCT和APACHEⅡ評分相比，PTX3是一個更有效的膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測的生物標志物。PTX3用于膿毒癥診斷時的ROC曲線下面積為0.963，當其濃度高于2.43 ng/ml時診斷膿毒癥的敏感性和特異性均超過90％; PTX3用于膿毒癥預(yù)后預(yù)測時的ROC曲線下面積為0.928，當其濃度高于3.16 ng/ml時預(yù)測膿毒癥預(yù)后的敏感性和特異性均超過80％。
　　

11、綜上所述，本研究采用iTRAQ標記蛋白質(zhì)組學方法篩選出一批與大鼠膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測相關(guān)的生物標志物，并選擇最佳生物標志物建立了膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)了六個與膿毒癥診斷相關(guān)的生物標志物:PTX3，MMRN1，F(xiàn)CN1，CPN2，PRSS1和PF4，并發(fā)現(xiàn)四個與膿毒癥預(yù)后預(yù)測相關(guān)的生物標志物:MMRN1，PPBP, FGα和FGβ。經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，PTX3作為膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測的生物標志物，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)的生物標志物PCT和CR