基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)前列腺癌血清、尿液蛋白質(zhì)標(biāo)志物的聯(lián)合篩查及診斷評(píng)價(jià)的研究.pdf

1、目的：
　　本研究中我們應(yīng)用非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，分析比較良性前列腺增生、高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤、局限性前列腺癌和前列腺癌伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者外周血清、含前列腺液的尿液中差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并利用經(jīng)典的ELISA、Western-blot技術(shù)在更大的獨(dú)立樣本中進(jìn)行了大樣本驗(yàn)證，從而篩選出前列腺癌早期診斷及預(yù)測(cè)進(jìn)展的腫瘤標(biāo)志物;同時(shí)我們對(duì)篩選出來(lái)的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析以及功能分析，

2、并檢測(cè)其在前列腺組織中的表達(dá)差異，旨在進(jìn)一步探討其在前列腺癌發(fā)病機(jī)制中的功能作用。
　　方法：
　　一、標(biāo)本收集
　　1、共收集前列腺疾病患者外周血血清、含有前列腺液的尿液166例。
　　(1)良性前列腺增生組(BPH):2012年2月至2013年4月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科就診的良性前列腺增生患者外周血血清、含前列腺液的尿液48例;
　　(2)高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤組(HGPIN):收集患者外周血

3、血清、含前列腺液的尿液32例;
　　(3)局限性前列腺癌組(Localized PCa):收集患者外周血血清、含前列腺液的尿液47例。
　　(4)前列腺癌伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(Metastatic PCa):收集患者外周血血清、含前列腺液的尿液39例。
　　2、共收集前列腺組織標(biāo)本57例
　　(1)良性前列腺增生標(biāo)本31例:來(lái)源于恥骨上開(kāi)放性前列腺切除術(shù)。
　　(2)前列腺癌標(biāo)本26例:來(lái)源于腹腔鏡或開(kāi)放根治性前列

4、腺切除術(shù)。所有標(biāo)本均經(jīng)我院病理科醫(yī)師讀片證實(shí)。
　　二、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)對(duì)血清、尿液差異蛋白質(zhì)的篩選
　　腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展具有序貫性的特征，為了鑒定和區(qū)別前列腺腫瘤在不同階段的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，我們分別收集了4組患者（良性前列腺增生、高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤、局灶性前列腺癌以及伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌）的血清和尿液樣本。其中良性前列腺增生組作為正常對(duì)照，高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤變組作為前列腺癌的癌前病變，其余2

5、組則代表著前列腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段。用Proteo miner試劑盒對(duì)混合后的樣本進(jìn)行去除血清高豐度蛋白，然后提取蛋白;對(duì)提取后的蛋白樣品進(jìn)行還原烷基化處理，打開(kāi)二硫鍵，便于后續(xù)步驟充分酶解蛋白;然后應(yīng)用Brandford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定;SDS（十二烷基磺酸鈉）-PAGE并取等量蛋白Trypsin酶解;用iTRAQ試劑標(biāo)記肽段;將標(biāo)記后的肽段進(jìn)行等量混合;對(duì)混合后的肽段使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(StrongCation Excha

6、nge Choematography，SCX)進(jìn)行預(yù)分離;最后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandem massspectrometry,LC-MS/MS)分析。
　　三、生物信息學(xué)分析及候選標(biāo)志物的預(yù)測(cè)
　　1、生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用Mascot檢索軟件、GO注釋、COG注釋、Pathway代謝通路注釋、多樣品間表達(dá)模式聚類(lèi)分析等生物信息學(xué)方法對(duì)差異蛋白進(jìn)

7、行功能分析。
　　2、候選蛋白質(zhì)標(biāo)志物的選擇標(biāo)準(zhǔn)
　　(1)在PCa組、HGPIN組與BPH對(duì)照組血清、尿液之間差異顯著，血清組表達(dá)差異在1.2倍以上，尿液組表達(dá)差異在2.0倍以上，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(2)差異重復(fù)性好，在Localized PCa及Metastatic PCa中穩(wěn)定表達(dá)，具有共同的上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)的蛋白質(zhì)。
　　(3)質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)，信噪比高。
　　(4)完成功能檢

8、索，提示蛋白質(zhì)具有重要的生理功能，在腫瘤發(fā)生及代謝過(guò)程中具有較重要的生物學(xué)作用。
　　四、ELISA技術(shù)對(duì)血清候選標(biāo)志物的定量分析
　　血清樣本中，應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)測(cè)定血清中差異蛋白質(zhì)表達(dá)水平，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　五、Western-blot技術(shù)對(duì)尿液候選標(biāo)志物的驗(yàn)證分析
　　對(duì)收集的含有前列腺液的尿液樣本應(yīng)用

9、超濾離心管濃縮、富集尿液蛋白質(zhì)。取蛋白樣品溶液上樣，恒流電泳15mA膠，2小時(shí)。將電泳后的膠按照8層濾紙-PDVF膜-凝膠-8層濾紙順序制作轉(zhuǎn)膜三明治，恒流1mA/cm2，1小時(shí)轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜常溫封閉2小時(shí)，加一抗，4℃孵育過(guò)夜。加二抗，室溫2小時(shí)。ECL顯示條帶，捕獲圖象并分析目標(biāo)帶光密度值。
　　六、免疫組化(IHC)技術(shù)檢測(cè)差異蛋白質(zhì)在前列腺組織中的表達(dá)差異
　　對(duì)收集的前列腺組織進(jìn)行石蠟切片。石蠟切片脫蠟、復(fù)水;

10、3％H2O2，室溫20min; L.A.B.抗原修復(fù)，60℃，20min;10％血清封閉，室溫30min;一抗（兔抗人PF4V1，1∶400，兔抗人CRISP3，1∶200）4℃，過(guò)夜:生物素化山羊抗兔二抗IgG，室溫15min;滴加SABC復(fù)合物，室溫20min; DAB顯色;脫水、封片。
　　七、結(jié)果統(tǒng)計(jì)
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)與四分位數(shù)表示，對(duì)于服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)于不服從正態(tài)分布的

11、數(shù)據(jù)，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic curve，ROC)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)標(biāo)志物在前列腺癌診斷及預(yù)后判斷中的敏感性及特異性。
　　結(jié)果：
　　一、iTRAQ技術(shù)對(duì)血清差異蛋白質(zhì)的鑒定
　　應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法血清中鑒定差異蛋白，在患者外

12、周血血清中共鑒定到蛋白質(zhì)825個(gè)，其中相對(duì)于良性前列腺增生，在前列腺癌中表達(dá)差異在1.2倍以上的蛋白質(zhì)12個(gè)，其中8個(gè)表達(dá)上調(diào)，4個(gè)表達(dá)下調(diào)。這12個(gè)差異蛋白的功能主要涉及到細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等生物過(guò)程。
　　二、iTRAQ技術(shù)對(duì)含有前列腺液的尿液中差異蛋白質(zhì)的鑒定
　　同上，應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定尿液中差異蛋白，在患者進(jìn)行前列腺按摩后的前段尿中共鑒定到蛋白質(zhì)2370個(gè)。相對(duì)于良性前列腺增生

13、，在前列腺癌中表達(dá)差異在2.0倍以上的蛋白質(zhì)68個(gè)，其中23個(gè)表達(dá)上調(diào)，45個(gè)表達(dá)下調(diào)。這68個(gè)差異蛋白的功能主要涉及到應(yīng)激反應(yīng)、脂類(lèi)代謝、腫瘤發(fā)育、細(xì)胞構(gòu)成等生物過(guò)程。
　　三、ELISA技術(shù)對(duì)血清候選標(biāo)志物的驗(yàn)證
　　我們應(yīng)用ELISA技術(shù)對(duì)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)篩選得到的2個(gè)血清候選標(biāo)志物(PF4V1、APOC2)在一個(gè)獨(dú)立的大樣本中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　四、Western-blot技術(shù)對(duì)尿液候選標(biāo)志物的驗(yàn)證<

14、br>　　在前列腺按摩后的尿液樣本中，CRISP3表達(dá)量在PCa中較BPH中表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與iTRAQ結(jié)果相符。作為單獨(dú)的前列腺癌診斷標(biāo)志物，ROC曲線AUC值為0.868(95％ CI，0.798-0.938)，診斷的敏感性和特異性分別為78.79％(95％CI，67.0％-87.9％)和84.21％(95％CI，68.7％-94.0％)。
　　五、血清、尿液標(biāo)志物聯(lián)合診斷前列腺癌的效能評(píng)價(jià)
　　應(yīng)用R

15、OC曲線分析結(jié)果顯示:聯(lián)合應(yīng)用PF4V1、CRISP3及PSA三者診斷前列腺癌的曲線下面積AUC為0.941(95％CI，0.901-0.981)，診斷的敏感性和特異性分別為81.82％(95％CI，70.4％-90.2％)和94.74％(95％CI，82.3％-99.4％)，其診斷效能明顯優(yōu)于單獨(dú)血清PSA的AUC值0.757(95％ CI，0.663-0.851)(P＜0.001)。此外，在PSA為4～10ng/ml的診斷灰區(qū)，聯(lián)合

16、應(yīng)用血清標(biāo)志物PF4V1及尿液標(biāo)志物CRISP3診斷前列腺癌的曲線下面積AUC值為0.895(95％ CI，0.781-1.000)，診斷的敏感性和特異性分別為76.19％(95％ CI，52.8％-91.8％)和90.00％(95％CI，55.5％-99.7％)，優(yōu)于PSA的AUC值0.698(95％ CI，0.504-0.891)，提示血清、尿液標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用在早期前列腺癌診斷中具有較好的診斷效能。
　　六、PF4V1及CR

17、ISP3在前列腺組織中的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示，PF4V1為胞漿染色，主要表達(dá)在前列腺增生組織的腺管上皮細(xì)胞內(nèi)，前列腺間質(zhì)組織幾無(wú)表達(dá)，而在前列腺癌組織中則為陰性表達(dá)。CRISP3為胞漿染色，其在前列腺癌細(xì)胞中染色為中度到強(qiáng)陽(yáng)性，而在正常前列腺腺體的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中則為陰性到弱陽(yáng)性染色。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)在前列腺癌患者的血清、尿液中聯(lián)合篩查前列腺癌標(biāo)志物，我們應(yīng)用該

18、技術(shù)成功獲得了前列腺癌患者血清和尿液中的差異蛋白質(zhì)譜。
　　2、我們結(jié)合ELISA和Western-blot技術(shù)對(duì)差異蛋白質(zhì)在獨(dú)立的大樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，并分別得到了血清、尿液蛋白質(zhì)標(biāo)志物（PF4V1、CRISP3），結(jié)果顯示候選標(biāo)志物在前列腺癌診斷中具有較高的敏感性和特異性，兩者的聯(lián)合診斷大大提高了前列腺癌無(wú)創(chuàng)診斷效能。
　　3、APOC2作為單獨(dú)的預(yù)后指標(biāo)具有較好的預(yù)測(cè)判斷價(jià)值，其在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者外周血清中表達(dá)明