胰腺癌血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究及候選腫瘤標志蛋白的驗證與評價.pdf

1、研究背景近年來，胰腺癌在我國的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。目前胰腺癌的5年生存率只有4％左右，在所有癌癥中最低。其主要原因為診斷晚、手術(shù)切除率低。因此提高胰腺癌的早期診斷水平是改善預(yù)后的關(guān)鍵。此外，在臨床實際工作中，慢性胰腺炎與胰腺癌的鑒別有時非常困難，但兩者的處理方法和預(yù)后卻迥然不同。 血清CA19-9是目前應(yīng)用最廣泛的胰腺癌腫瘤標志物，但人群中約有10％～15％的Lewis陰性者不分泌CA19-9，此外CA19-9對于早期胰腺

2、癌的診斷價值有限。因此尋找新的有助于胰腺癌早期診斷和鑒別診斷的標志物具有重要意義。 蛋白質(zhì)組學(xué)是20世紀90年代新出現(xiàn)的一門學(xué)科，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤等疾病的研究，發(fā)現(xiàn)了一批新的候選蛋白標志物。同樣，蛋白質(zhì)組學(xué)也為胰腺癌的研究帶來了新的思路和方法。LuZH等利用二維凝膠電泳(2-DE)的方法對胰腺癌組織和癌旁正常胰腺組織進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，共發(fā)現(xiàn)和鑒定了110種在癌組織中差異表達的蛋白。此外也有研究利用近幾年新出現(xiàn)的表面增

3、強激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)的方法在胰液和血清中尋找胰腺癌的標志物。但利用2-DE這種經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)方法進行胰腺癌血漿的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚未見報道。 研究目的1.利用2-DE方法比較胰腺癌(術(shù)前、術(shù)后)、正常人和慢性胰腺炎患者血漿中的差異蛋白，尋找和鑒定與胰腺癌相關(guān)或特異的生物標志分子。 2.對LuZH等在胰腺癌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究中所發(fā)現(xiàn)的2種候選標志蛋白(Galectin-3和Annexi

4、nⅠ)進行驗證，并評價其對胰腺癌的診斷價值。 研究對象和方法1.胰腺癌血漿的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究·選擇12例胰腺癌患者以及與之性別年齡匹配的12例正常人和10例慢性胰腺炎患者的血漿標本進行研究。 ·對去除白蛋白(ALB)和IgG以及超濾去除大分子等預(yù)分離方法進行摸索和評價，確定最佳的血漿2-DE方案。 ·通過比較胰腺癌(術(shù)前、術(shù)后)、正常人和慢性胰腺炎患者的血漿2-DE圖譜，尋找差異蛋白并進行質(zhì)譜鑒定。 2

5、.候選腫瘤標志蛋白的驗證與評價·分別對59例和33例胰腺癌患者的組織標本進行Galectin-3和AnnexinⅠ的免疫組化研究。比較這兩種蛋白在癌組織和癌旁正常胰腺組織中的表達情況。 ·利用ELISA試劑盒檢測血清和胰液的Galectin-3水平，比較胰腺癌與對照之間的差異，評價血清和胰液Galectin-3對胰腺癌的診斷價值。血清標本包括42例胰腺癌，77例正常和其他消化系統(tǒng)疾病對照。胰液標本包括24例胰腺癌，16例胰膽良性

6、疾病。 ·利用能夠檢測抗原抗體反應(yīng)的光學(xué)蛋白芯片(Opticalproteinchip，OPC)系統(tǒng)對血清和胰液進行AnnexinⅠ的初步檢測和分析。血清標本包括13例胰腺癌，19例正常及消化系統(tǒng)良性疾病對照。胰液標本包括4例胰腺癌和4例胰膽良性疾病。 結(jié)果1.胰腺癌血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究·去除ALB和IgG的預(yù)處理使血漿2-DE圖譜的局部分辨率提高，同時由于上樣量的增加，有利于一些含量較低蛋白的質(zhì)譜鑒定。但這種預(yù)處理方法并

7、不能明顯增加蛋白點數(shù)。 ·超濾的方法可以有效地去除包括部分高豐度蛋白在內(nèi)的大分子蛋白，有利于小分子蛋白的顯示和質(zhì)譜鑒定。但此方法仍然難以顯示低豐度蛋白。 ·通過血漿2-DE圖譜的比較，共發(fā)現(xiàn)并鑒定了5種與胰腺癌或慢性胰腺炎相關(guān)的差異蛋白：Haptoglobin(Hp)、Hemoglobin(Hb)、α1-antitrypsin(α1AT)、ImmunoglobinJchain(IgJ)和Leucine-richα2-gl

8、ycoprotein(LRG)。 ·Hpβ鏈在胰腺癌患者中輕度升高，胰腺癌患者的Hp2-2表型的比例高于正常人，而缺少Hp1-1表型。胰腺癌和慢性胰腺炎患者的血漿Hb高于正常人，升高范圍＞2倍。在20～kDa的區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與α1AT序列相同的蛋白，可能為α1-AT的片斷，此蛋白與正常區(qū)域內(nèi)的α1AT變化大致相同，即慢性胰腺炎＞胰腺癌＞正常人。慢性胰腺炎患者的IgJ鏈高于胰腺癌患者和正常人，可能來源于血漿中的分泌型IgA(sIgA

9、)。胰腺癌患者的LRG水平較正常人和慢性胰腺炎輕度升高。術(shù)后Hp、正常區(qū)域內(nèi)的α1AT和LRG均明顯升高，未發(fā)現(xiàn)術(shù)后明顯下降的蛋白。 2.候選腫瘤標志蛋白的驗證與評價·胰腺癌組織Galectin-3的表達水平高于癌旁正常胰腺導(dǎo)管，表達情況與分期、分化等臨床病理指標之間沒有顯著相關(guān)。 ·胰腺癌組織AnnexinⅠ的表達水平與癌旁正常胰腺癌導(dǎo)管相比沒有顯著性差異，但癌旁正常胰腺腺泡無AnnexinⅠ的表達，因此癌組織Anne

10、xinⅠ的總量高于癌旁正常胰腺組織。胰腺癌中AnnexinⅠ的表達程度似乎與性別和年齡有關(guān)，但表達情況與分期、分化沒有明顯相關(guān)。 ·胰腺癌患者的血清Galectin-3高于正常人(中位數(shù)13.1ng/ml：9.85ng/ml，P＜0.005)。但與消化系統(tǒng)良性疾病和惡性疾病相比沒有顯著差異。以10.3ng/ml為cutoff值，診斷胰腺癌和正常人的敏感性和特異性分別為73.8％和55.3％。腫瘤切除后血清Galectin-3水平

11、增加。血清Galectin-3水平與胰腺癌分期沒有明顯相關(guān)。 ·大部分胰腺癌患者和所有良性疾病患者的胰液中均能檢測到Galectin-3，但兩組之間沒有顯著性差異。以13.7ng/ml為cutoff值，其鑒別胰腺癌和胰腺良性疾病的特異性可達93.7％，但敏感性只有37.5％。 ·OPC系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，大部分血清標本的檢測值高于抗體對照，胰腺癌和良性疾病的檢測值有高于正常人的趨勢。而所有胰液標本的檢測值均與抗體對照相差不

12、大。 結(jié)論1.去除ALB和IgG以及超濾去除大分子的預(yù)處理方法對于血漿蛋白的差異比較并無太大優(yōu)勢。但在質(zhì)譜鑒定方面可以與未處理的方法互相補充。 2.2-DE方法能夠同時發(fā)現(xiàn)多個血漿蛋白的量及表型的差異，但與SELDI-TOF方法一樣，限于血漿蛋白豐度的巨大動態(tài)范圍，難以發(fā)現(xiàn)中低豐度蛋白的差異。 3.在我們所發(fā)現(xiàn)的5種差異蛋白中，Hp的表型、Hb、IgJ鏈和LRG與胰腺癌/慢性胰腺炎的關(guān)系在以往的文獻中并無報道，這

13、些差異蛋白對于胰腺癌或慢性胰腺炎的意義及診斷價值還需要進一步的驗證。 4.免疫組化的結(jié)果證實了胰腺癌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果，即癌組織Galectin-3和AnnexinⅠ的總量高于癌旁正常胰腺組織，但如果與癌旁正常胰腺導(dǎo)管相比，則癌組織中Galectin-3過表達，但AnnexinⅠ無過表達。因此提示對于組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果還需要利用免疫組化等方法做進一步的驗證和分析。 5.血Galectin-3對于診斷胰腺癌和正