胰腺癌細胞株耐藥蛋白質組學研究：熱休克蛋白對TRAIL誘導凋亡的調節(jié)作用.pdf

1、胰腺癌是一種極具侵襲性的癌癥類型,是因癌癥死亡的主要原因之一,世界范圍內僅2000年就有超過200,000人死于此疾病。胰腺癌有其特征性的基因類型,常發(fā)生K-ras、p53、p16INK4α及Smad 4的基因突變。胰腺癌的高致死率是因其對化療和放射治療不敏感,因此需要研究與探索新的治療方法。免疫監(jiān)督抑制腫瘤發(fā)生時,腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)正常表達于自然殺傷細胞,因此是一種天然的腫瘤殺傷因子。已有許多證據表明,可將TR

2、AIL用于人類胰腺癌的治療：①胰腺癌細胞表面表達TRAIL死亡受體DR4、DR5;②重組可溶性TRAIL可誘導胰腺癌細胞發(fā)生凋亡；③給胰腺癌移植瘤小鼠注射表達TRAIL的腺病毒載體可抑制腫瘤生長；④TRAIL聯合用藥可抑制胰腺癌病人的腫瘤生長。然而大多數胰腺癌細胞卻對TRAIL誘導凋亡的作用并不敏感,其原因就是胰腺癌細胞存在抵抗TRAIL介導凋亡的機制。 信號通路中TRAIL誘導的凋亡由多水平調節(jié),故TRAIL在進入胰腺癌臨床試

3、驗前需闡明其抵抗機制。蛋白質組學基礎上的研究方法可以定量研究復雜的細胞蛋白質圖譜變化以及蛋白質-蛋白質之間的相互作用,可監(jiān)控不同生理條件下的分子變化過程。本論文采用細胞與分子生物學和蛋白組學方法研究差異表達蛋白,并進一步通過免疫共沉淀分析差異蛋白的相互作用及其在p53蛋白功能調節(jié)中的作用。我們的研究結果首次闡明HSP27與HSPA8可通過與p53蛋白相互作用來調節(jié)TRAIL誘導的凋亡,揭示了一種新的胰腺癌細胞耐藥機制。 第一部分

4、 TRAIL對胰腺癌細胞誘導的凋亡作用以及胰腺癌細胞TRAIL受體的表達 采用MTT法測定TRAIL對胰腺癌細胞株SW1990和PANC1的增殖抑制,通過倍比梯度稀釋,計算兩種細胞在不同藥物濃度作用下的增殖抑制率,以此來鑒定腫瘤細胞株對TRAIL的敏感性。通過AnnexinV-FITC雙染法研究TRAIL處理后兩種胰腺癌細胞株的凋亡發(fā)生率。通過逆轉錄PCR法(RT-PCR)分析2種細胞株中TRAIL受體(DR4,DR5,DcR1

5、及DcR2)在mRNA水平的表達情況,了解受體表達量的高低是否與其對藥物的敏感性相關。研究結果發(fā)現:TRAIL,對SW1990細胞有明顯的增殖抑制作用(IC50=0.074μg/ml),且該作用呈劑量依賴性,而對PANC1細胞的作用則不明顯(IC50=0.65μg/ml);在相同的藥物濃度下,流式細胞檢測兩種細胞的凋亡率有顯著的差異,該結果與細胞增殖抑制試驗相一致,證明TRAIL以誘導凋亡的方式使細胞死亡；RT-PCR顯示,TRAIL受

6、體mRNA的表達與其敏感性無直接關聯,提示胰腺癌細胞對于TRAIL的抵抗更依賴于胞內機制的調節(jié)。 第二部分蛋白組學技術研究TRAIL誘導前后細胞差異表達蛋白 依照文獻,采用循環(huán)反復凍融法提取細胞總蛋白,Bradford法蛋白定量。雙向電泳分離藥物作用前后細胞總蛋白,獲得分辨率高、重復性好的雙向電泳譜圖譜。敏感株SW1990與耐藥株PANC1的pH 3-10的圖譜顯示平均蛋白點分別為620±15和550±23。PDQues

7、t 7.4軟件圖像分析比對,以兩倍差異為閾值得到差異蛋白點58個,質譜成功鑒定38個。功能預測顯示與細胞凋亡、細胞分化、蛋白質折疊、蛋白質氧化還原、分子伴侶等相關。兩種細胞存在8個共同差異蛋白,值得關注的是HSP27和HSPA8,它們在兩種細胞中的差異截然相反,如SW1990表現為游離態(tài)的HSP27低表達,而游離態(tài)的HSPA8高表達；PANC1呈完全相反的現象。推測兩者可能參與TRAIL誘導細胞凋亡的調節(jié)過程,具體機制尚需進一步研究。

8、 第三部分質譜結果驗證及差異蛋白相互作用的功能研究 采用western-blot在蛋白水平、半定量RT-PCR在mRNA水平進行質譜結果的驗證。結果顯示HSP27和HSPA8在敏感株和耐藥株中的表達差異與雙向電泳結果一致,證明質譜結果可信。借助信號轉導研究工具PathwayAssist 3.08建立了生物分子相互作用關系網絡,研究發(fā)現HSP27、HSPA8可分別與p53蛋白結合并發(fā)生相互作用,進而調節(jié)p53下游相關基因(B

9、AX/Bcl-2、FAS/APO1及IGF-BP3等)的表達,從而調控細胞凋亡過程。該部分利用免疫共沉淀(IP)實驗研究發(fā)現,p53可同時與HSP27和HSPA8結合形成三重復合物,且藥物誘導后兩種蛋白與p53的親和力發(fā)生改變,SW1990表現為HSP27與p53的親和力增加,而HSPA8與之的親和力下降；PANC1呈完全相反的現象。該結果揭示,在TRAIL誘導的凋亡中,HSP27可能為一種正性調控因子,而HSPA8可能為一種負性調控因