幽門(mén)螺桿菌毒素相關(guān)蛋白CagA處理胃癌細(xì)胞株后比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:用含幽門(mén)螺桿菌NCTC11637(Helicobacter pylori，Hp)毒素相關(guān)基因A(cytotoxin associated gene A，cagA)的真核表達(dá)載體pcDNA3.1ZEO(-)/cagA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞模型;用幽門(mén)螺桿菌NCTC11637直接感染胃癌細(xì)胞建立細(xì)胞模型，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，尋找并鑒定差異蛋白，為幽門(mén)螺桿菌感染引起胃癌的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法

2、:采用本課題組保存的真核表達(dá)載體pcDNA3.1ZEO(-)/cagA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞株;培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌NCTC11637感染AGS細(xì)胞和SGC-7901胃癌細(xì)胞株;分別提取感染與轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白進(jìn)行雙向電泳。ImageMaster6.0分析2D膠，尋找三組實(shí)驗(yàn)重疊的差異點(diǎn)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析

3、、SEQUEST軟件進(jìn)行鑒定，經(jīng)NCBI查詢(xún)蛋白質(zhì)相關(guān)信息。
　　結(jié)果:對(duì)成功構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株SGC-7901/cagA，以及Hp感染的高表達(dá)CagA胃癌細(xì)胞分別行雙向電泳后，得到結(jié)果如下:
　　1.AGS感染實(shí)驗(yàn):AGS PC（活Hp感染的AGS細(xì)胞）與AGS NC（死Hp感染的AGS細(xì)胞）組:通過(guò)雙向電泳，分別分離的蛋白質(zhì)有1373和1120個(gè)，共有39個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在兩組凝膠中有顯著差異表達(dá)，其中蛋白表達(dá)上調(diào)的有25個(gè)，

4、蛋白表達(dá)下調(diào)的有14個(gè);
　　2.SGC-7901感染實(shí)驗(yàn):SGC-7901 PC(活Hp感染的SGC-7901細(xì)胞)，SGC-7901NC(死Hp感染的SGC-7901細(xì)胞)通過(guò)雙向電泳，分別分離的蛋白質(zhì)有1220和1332個(gè)，共有51個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在兩組凝膠中有顯著差異表達(dá)，其中蛋白表達(dá)上調(diào)的有22個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白有29個(gè);3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):SGC-7901/cagA PC(含cagA的真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC-7901組)

5、與SGC-7901/cagA NC（含cagA的真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC-7901對(duì)照組）:通過(guò)雙向電泳，分別分離的蛋白質(zhì)有941和977個(gè)，共有45個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在兩組凝膠中有顯著差異表達(dá)，在SGC-7901/cagA PC中表達(dá)量升高的蛋白斑點(diǎn)有26個(gè)，在SGC-7901/cagA NC中表達(dá)量升高的蛋白斑點(diǎn)有19個(gè)。對(duì)所選取的15個(gè)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，得到乳酸脫氫酶、鈣網(wǎng)織蛋白、二氫硫辛酰胺脫氫酶前體等，這些蛋白質(zhì)功能涉及細(xì)

6、胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激等。
　　結(jié)論:1.成功建立Hp感染胃癌細(xì)胞株SGC-7901、AGS感染模型;
　　2.成功建立pcDNA3.1ZEO(-)/cagA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901模型;
　　3.通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)Hp及其對(duì)照感染胃癌細(xì)胞株SGC-7901、AGS，pcDNA3.1ZEO(-)/cagA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901及其對(duì)照進(jìn)行研究，總共篩選出15個(gè)共同蛋白差異點(diǎn)，鑒定出11個(gè)蛋白，這