幽門螺桿菌響應(yīng)環(huán)境脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)主要定植于人胃粘膜上皮細(xì)胞，是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素，與胃癌及胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤發(fā)生密切相關(guān)，1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將其列為I類致癌因子。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糞-口途徑是幽門螺桿菌的重要傳播途徑之一，該菌在體內(nèi)存活及體外傳播過程中必然會遭受到多種環(huán)境壓力的脅迫，細(xì)菌通過啟動一系列的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制來抵抗這些脅迫因

2、素以達(dá)到保種生存并導(dǎo)致疾病的目的。 幽門螺桿菌的一個顯著特征就是能夠在人胃的極端酸性環(huán)境中生存，人胃腔內(nèi)的pH值在饑餓時可低達(dá)1.0，在自酸性的胃腔向胃粘膜層移動過程中，幽門螺桿菌不可避免的應(yīng)對pH值的不斷波動。現(xiàn)今研究較清楚的幽門螺桿菌抗酸機(jī)制就是其脲素酶系統(tǒng)，脲素酶可分解脲素產(chǎn)生氨和二氧化碳來提高細(xì)菌微環(huán)境的pH值，然而，胃液內(nèi)的脲素濃度往往約為1mM，僅通過該系統(tǒng)不能完全保證幽門螺桿菌在酸性胃環(huán)境的存活。因此，推測在幽門螺

3、桿菌的酸性應(yīng)答過程中還存在其它的pH平衡系統(tǒng)。 餐后膽汁返流入胃是一種正常的生理現(xiàn)象，患有胃腸道疾病者此現(xiàn)象更為嚴(yán)重；許多研究證明糞-口途徑是幽門螺桿菌進(jìn)入人體消化道的一種重要途徑，那么在其傳播過程中，幽門螺桿菌必定經(jīng)過富含膽汁的腸道，耐受并抵抗膽汁對它的脅迫作用；另外，人們利用聚合酶鏈反應(yīng)和DNA印跡等方法在膽汁，膽囊和肝組織中檢測到幽門螺桿菌的存在。以上均說明幽門螺桿菌對膽汁的耐受性是其在人類胃腸道定植和生存重要機(jī)制，幽門螺

4、桿菌通過何種機(jī)制在富含膽汁的環(huán)境中生存還不清楚。形態(tài)學(xué)改變是細(xì)菌抗逆生存的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一，在O2壓力，低pH值等不利的培養(yǎng)條件下或抗菌治療后，幽門螺桿菌可轉(zhuǎn)變?yōu)榛畹姆强膳囵B(yǎng)狀態(tài)的球形體，這種形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變是一種積極的生物學(xué)應(yīng)答過程，是幽門螺桿菌的一種保護(hù)性抗逆生存機(jī)制。當(dāng)細(xì)菌受到脅迫時也可進(jìn)入非分裂狀態(tài)，這在醫(yī)學(xué)研究上具有重要意義。已有研究證明當(dāng)細(xì)菌的分裂被抑制而它們的生長仍在繼續(xù)時細(xì)菌可轉(zhuǎn)變成絲狀體形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌在高鹽培養(yǎng)基中

5、于靜止早期可形成絲狀體結(jié)構(gòu)，胺曲南也可以誘導(dǎo)幽門螺桿菌絲狀體的形成。因此，對其絲狀體的研究有可能發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌的細(xì)菌分裂檢查點。 基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)都是整體的高通量的生物技術(shù)體系，它們的興起推動了生命科學(xué)各個分支突飛猛進(jìn)的發(fā)展。蛋白質(zhì)是生命活動的直接執(zhí)行者，由于翻譯和轉(zhuǎn)錄后修飾的影響，mRNA水平的變化不能完全反映蛋白質(zhì)豐度的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是在整體水平上高通量的解析基因組所表達(dá)的體現(xiàn)生命活動特征的蛋白質(zhì)的變化規(guī)律，并

6、且蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被證實是研究細(xì)菌應(yīng)對各種不同環(huán)境壓力的生理性適應(yīng)反應(yīng)的有力工具，幽門螺桿菌的兩個菌株(H.pylori26695和H.pyloriJ99)的全基因組序列已經(jīng)測序完成，為了充分利用這些生物信息學(xué)資源，本研究通過高通量的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析了幽門螺桿菌在酸，膽汁等壓力條件下及幽門螺桿菌非分裂狀態(tài)絲狀體的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，旨在為闡明幽門螺桿菌在體內(nèi)外的生存機(jī)制提供有價值的理論基礎(chǔ)。 本學(xué)位論文的主要研究內(nèi)容及實驗結(jié)果如下

7、： 一.幽門螺桿菌在無脲素存在時對酸性脅迫的蛋白質(zhì)反應(yīng)酸性脅迫是幽門螺桿菌在人胃內(nèi)面臨的最大挑戰(zhàn)，當(dāng)幽門螺桿菌暴露于酸性環(huán)境時，脲素酶系統(tǒng)是其保持胞內(nèi)及胞質(zhì)pH接近于中性的基本調(diào)節(jié)機(jī)制，然而，胃液內(nèi)的脲素濃度往往在1mM左右，僅僅通過分解脲素不足以有效保證幽門螺桿菌應(yīng)對酸的脅迫，因此推測幽門螺桿菌還存在其它的酸性調(diào)節(jié)機(jī)制。為了鑒定除脲素酶以外幽門螺桿菌存在的抗酸相關(guān)的蛋白分子，我們利用雙向凝膠電泳技術(shù)比較了該細(xì)菌在pH7.4，6

8、.0，5.0，4.0，3.0及2.0條件下暴露30分鐘后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，差異性的蛋白進(jìn)行MAlDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，共得到36個具有不同功能的蛋白質(zhì)分子的信息。這些蛋白參與產(chǎn)氨，分子伴侶，能量代謝，細(xì)胞外膜，信號調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，還有一些蛋白質(zhì)的功能至今仍不清楚，然后我們對差異性的蛋白進(jìn)行了SOM分析，結(jié)果顯示幽門螺桿菌通過多種蛋白的改變響應(yīng)酸性脅迫。二.幽門螺桿菌對人膽汁脅迫的蛋白質(zhì)反應(yīng)幽門螺桿菌對膽汁的耐受能力是其在人胃

9、腸道的定植和存活的重要機(jī)制，由于膽汁返流入低pH的胃內(nèi)可被酸化，因此本研究首先檢測了膽汁酸化前后對幽門螺桿菌抑制能力的改變，結(jié)果顯示膽汁的酸化后對幽門螺桿菌的抑制活性降低。然后，通過雙向凝膠電泳得到幽門螺桿菌在正常條件下及在膽汁和酸化膽汁脅迫下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，差異性蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常條件下的菌體蛋白相比，膽汁及酸化膽汁脅迫下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化規(guī)律相似。膽汁和酸化膽汁的存在使幽門螺桿菌28個菌體蛋

10、白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生變化，并且大多數(shù)蛋白是誘導(dǎo)表達(dá)。這些蛋白包括分子伴侶蛋白，參與鐵離子儲存的蛋白，趨化性蛋白，與能量代謝相關(guān)的酶類及編碼鞭毛裝置的蛋白等，這說明幽門螺桿菌通過對多種信號分子的調(diào)節(jié)應(yīng)對膽汁和酸化膽汁的脅迫。為了證實某些蛋白在幽門螺桿菌膽汁耐受中的作用，我們構(gòu)建了Hp0721和鞭毛馬達(dá)開關(guān)蛋白的基因缺失突變株，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)兩個突變株對膽汁脅迫的抵抗力有所降低，說明這兩個蛋白在幽門螺桿菌的膽汁調(diào)節(jié)反應(yīng)中起一定作用。 三.胺曲

11、南誘導(dǎo)的非分裂狀態(tài)幽門螺桿菌絲狀體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析處于壓力環(huán)境中，細(xì)菌可進(jìn)入非分裂狀態(tài)，這在醫(yī)學(xué)上具有重要意義。本研究利用胺曲南誘導(dǎo)了非分裂狀態(tài)的幽門螺桿菌絲狀體，細(xì)胞分裂時FtsI基因編碼細(xì)胞壁上參與肽聚糖交聯(lián)的一種轉(zhuǎn)肽酶，是一種青霉素結(jié)合蛋白，胺曲南可抑制該蛋白的功能從而阻止細(xì)胞分裂。我們運(yùn)用實時熒光定量PCR檢測了FtsI和其它幾個青霉素結(jié)合蛋白(Hp0597，Hp1565，Hp1372，Hp1373)在幽門螺桿菌絲狀體中的表達(dá)情

12、況，結(jié)果顯示FtsI在幽門螺桿菌絲狀體中低表達(dá)，而其它幾個青霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)水平與螺桿狀細(xì)菌相比并無明顯差異。為了尋找幽門螺桿菌可能存在的其它細(xì)胞分裂檢查點，我們利用雙向凝膠電泳技術(shù)比較了能夠正常分裂的螺桿狀和處于非分裂狀態(tài)的幽門螺桿菌絲狀體的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，在絲狀體中具有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點通過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，得到21個蛋白質(zhì)的信息。其中有一個與細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白在幽門螺桿菌絲狀體中被誘導(dǎo)表達(dá)，該蛋白是由MinD基