外陰鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、前言
　　外陰癌是婦科惡性腫瘤之一，常見于60歲以上的婦女。外陰鱗狀細(xì)胞癌是外陰癌最常見的類型，占所有外陰惡性腫瘤的90％以上。目前外陰癌的病因仍不清楚，危險(xiǎn)因素包括外陰營(yíng)養(yǎng)不良（如外陰硬化性苔蘚）、外陰人乳頭瘤病毒感染史、吸煙、外陰上皮內(nèi)瘤變、免疫缺陷綜合征及宮頸癌的病史等。隨著分子生物學(xué)研究進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)一些與外陰癌變相關(guān)的基因和蛋白，但確切的機(jī)制尚不清楚。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)是指以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，從整體的角度，分析細(xì)胞

2、內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成與活動(dòng)規(guī)律。與傳統(tǒng)的單個(gè)蛋白質(zhì)研究相比，蛋白質(zhì)組學(xué)采用高通量的研究方法，可同時(shí)篩選多個(gè)蛋白質(zhì)，在研究有關(guān)生命活動(dòng)機(jī)制的基本問題方面達(dá)到了空前的規(guī)模和速度。因此，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)即2D-DIGE（雙向熒光差異凝膠電泳）結(jié)合MALDI-TOF/TOF（基質(zhì)輔助激光解吸電離）質(zhì)譜鑒定的方法篩選外陰鱗癌組織及外陰正常組織之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，同時(shí)運(yùn)用Western blotting及免疫組化的方法對(duì)部分差異表達(dá)

3、蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，并將檢測(cè)的結(jié)果與臨床病理資料相結(jié)合進(jìn)行研究，最后通過甲基化研究分析外陰鱗癌組織及外陰正常皮膚組織中Galectin-7基因啟動(dòng)子甲基化的情況。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　一、蛋白質(zhì)組學(xué)
　?。ㄒ唬┛偟鞍椎奶崛　⒓兓岸?br>　　收集外陰鱗癌組織及外陰正常組織各6例進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取。按照2DClean-up Kit蛋白質(zhì)純化試劑盒的說明書對(duì)總蛋白質(zhì)進(jìn)行提純。按照2D Quant Kit蛋白質(zhì)定量試劑盒的說明

4、書進(jìn)行總蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。
　?。ǘ╇p向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)及圖像分析
　　對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記后進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦，然后將膠條進(jìn)行平衡后進(jìn)行第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的膠板進(jìn)行掃描后進(jìn)行分析。
　?。ㄈ㎝ALDI-TOF（基質(zhì)輔助激光解吸電離）質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析
　　凝膠樣品的制備及點(diǎn)樣后置于質(zhì)譜儀中進(jìn)行鑒定，通過查詢EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的蛋白質(zhì)

5、進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　二、免疫組化
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法分析35例外陰鱗癌組織及10例外陰正常皮膚組織中Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1及DPT的表達(dá)情況。
　　三、Western blotting
　　應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)10例外陰鱗癌組織及外陰正常皮膚組織中Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1及DPT的表達(dá)。
　　

6、四、臨床病理資料分析
　　對(duì)外陰鱗癌組織的免疫組化檢測(cè)結(jié)果與外陰鱗癌病例的臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行研究。
　　五、甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)
　　應(yīng)用MSP的方法對(duì)20例外陰鱗癌組織及12例外陰正常皮膚組織中Galectin-7基因啟動(dòng)子甲基化的情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、雙向熒光差異凝膠電泳中切取差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)78個(gè)，其中共有66個(gè)得到

7、鑒定結(jié)果。除去重復(fù)的蛋白質(zhì)，最終得到62個(gè)差異蛋白質(zhì)。其中，在外陰鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)為54個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)為8個(gè)。
　　2、通過查詢EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得62個(gè)差異蛋白的生物學(xué)功能及亞細(xì)胞定位。差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能多樣，其中主要包括凋亡(14.52％)，轉(zhuǎn)錄與翻譯(12.90％)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(9.68％)，免疫反應(yīng)(8.06％)，代謝酶(9.68％)，轉(zhuǎn)運(yùn)(12.90％)。對(duì)62個(gè)差異蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，其中

8、30個(gè)位于胞漿(49.21％)。
　　3、免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1，DPT陽性細(xì)胞均表達(dá)于外陰正常表皮細(xì)胞全層，呈細(xì)胞漿和細(xì)胞核陽性，在VSCC癌巢中有陽性細(xì)胞表達(dá)（其中DPT在VSCC癌巢細(xì)胞中無表達(dá)或弱表達(dá)），而間質(zhì)中無表達(dá)，并且兩者之間均有顯著性差異(P＜0.05)。其中GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1在外陰鱗癌組織中顯著高表達(dá)(P＜0.05)，Galectin-

9、7及DPT在外陰鱗癌組織中顯著低表達(dá)（P＜0.05）。
　　4、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示高分化外陰鱗癌組織中Galectin-7及DPT的表達(dá)明顯低于外陰正常皮膚組織(P＜0.05);高分化外陰鱗癌組織中GSTP1，Prx4，CFL1及Pfn1的表達(dá)明顯高于外陰正常皮膚組織(P＜0.05)。
　　5、甲基化特異性PCR檢測(cè)外陰鱗癌組織及外陰正常皮膚組織中Galectin-7啟動(dòng)子的甲基化情況發(fā)現(xiàn)在外陰鱗癌組織中G

10、alectin-7啟動(dòng)子甲基化的陽性率為80.0％，在外陰正常皮膚組織中甲基化的陽性率為33.3％，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)共篩選出62種差異蛋白，其中54種蛋白質(zhì)在外陰鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，8種蛋白質(zhì)在外陰鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)。
　　2、通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GSTP1，Prx4，CFL1及Pfn1在外陰鱗癌組織中顯著高表達(dá)，Galectin-7及DPT在外陰鱗癌組織中顯著低