轉(zhuǎn)錄因子SOX2在食管鱗癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、【背景】
　　食管癌是一類主要起源于食管鱗狀上皮和柱狀上皮的惡性腫瘤，在全球致死性疾病中排名第6位[1]。盡管食管腺癌近年來(lái)有增加的趨勢(shì)，但在世界上一些國(guó)家和我國(guó)仍以食管鱗癌為主[2]。食管癌確切病因尚未明確。轉(zhuǎn)錄因子SOX2定位于3號(hào)染色體上，以高度保守的高動(dòng)力群（high-mobilitygroup，HMG）為特征，SOX家族蛋白（包括SOX2）通過(guò)它們的HMG結(jié)構(gòu)域結(jié)合特定的DNA序列激活或抑制靶基因的表達(dá)[3]。SOX2在

2、干細(xì)胞研究、早期胚胎發(fā)生、器官形成及神經(jīng)分化等重要事件中都起著關(guān)鍵的作用，從而引起了廣泛的關(guān)注。研究表明，SOX2參與食管癌[4]、胃癌[5]、結(jié)腸癌[6]、肺癌[7]和乳腺癌[8]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，SOX2在食管癌中的研究還不十分清楚。有關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控的研究是生命科學(xué)的研究重點(diǎn)，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在SOX2的啟動(dòng)子區(qū)與Snail有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因而，我們推測(cè)是否SOX2與Snail通過(guò)相互作用參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。S

3、nail是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Snail在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中起重要的調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步了解SOX2在食管鱗癌中的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)對(duì)SOX2與Snail在食管鱗癌中的表達(dá)相關(guān)性及其功能進(jìn)行初步性探討。
　　【目的】
　　1.探討轉(zhuǎn)錄因子SOX2和Snail在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān)性。
　　2.構(gòu)建、鑒定SOX2的RNA干擾慢病毒載體及病毒的包裝、純化。

4、
　　3.初步探討SOX2在食道鱗癌中的功能。
　　【方法】
　　1.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)食管鱗癌、匹配癌旁組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中SOX2和Snail的表達(dá)，分析其與臨床病理資料的相關(guān)性。
　　2.Westernblot檢測(cè)SOX2和Snail在食管鱗癌細(xì)胞系EC109和EC9706中的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光觀察SOX2和Snail在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位。
　　3.設(shè)計(jì)并構(gòu)建兩個(gè)SOX2shRNA載

5、體，測(cè)序鑒定正確后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Westernblot驗(yàn)證干擾效率，干擾效果較好的序列構(gòu)建成帶GFP的SOX2shRNA慢病毒載體并包裝成慢病毒顆粒。
　　4.通過(guò)SOX2shRNA慢病毒感染EC109和EC9706，流式細(xì)胞儀無(wú)菌分選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)SOX2表達(dá)變化。
　　5.Wst-1法繪制生長(zhǎng)曲線、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察感染SOX2shRNA病毒對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。

6、　　【結(jié)果】
　　1．SOX2和Snail在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)。
　　1)SOX2在食管鱗癌組織表達(dá)陽(yáng)性率為51％（29例/57例），明顯高于其匹配的癌旁組織16％（9例/57例），提示SOX2在食管鱗癌組織中表達(dá)增高（P<0.05）。另外在40例食管鱗癌及其相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中，SOX2在原發(fā)灶表達(dá)陽(yáng)性率為45％（18例/45例），Snail的表達(dá)陽(yáng)性率為68％（27例/40例），在轉(zhuǎn)移灶中SOX2表達(dá)陽(yáng)性率為

7、28％（11例/40例），Snail為65％（26例/40例）。SOX2和Snail在食管鱗癌組織及其相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)具有正相關(guān)性（r=0.538,P<0.05）。
　　2)SOX2和Snail的在食管鱗癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度和TNM分期等參數(shù)無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　3)Westernblot結(jié)果顯示，SOX2和Snail均在食管癌細(xì)胞系EC109和EC9706中表達(dá)。細(xì)胞免疫

8、熒光觀察SOX2和Snail在EC109和EC9706中表達(dá)且共定位在細(xì)胞核。
　　2．成功構(gòu)建了兩個(gè)SOX2shRNA載體，測(cè)序結(jié)果正確。Westernblot驗(yàn)證載體干涉有效，其中一個(gè)干涉效果較好的序列構(gòu)建成帶GFP熒光的慢病毒載體，包裝純化成慢病毒顆粒。
　　3．進(jìn)一步探討SOX2在食管鱗癌發(fā)生與發(fā)展中的作用。
　　1)用SOX2shRNA慢病毒直接感染EC109和EC9706細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選出帶GFP的陽(yáng)性

9、細(xì)胞，Westernblot證實(shí)成功獲得SOX2表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　2)免疫熒光檢測(cè)感染SOX2shRNA病毒的EC9706細(xì)胞中SOX2和Snail熒光強(qiáng)度均較感染陰性對(duì)照病毒的細(xì)胞減低。
　　3)Wst-1方法檢測(cè)不同感染細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，結(jié)果顯示，下調(diào)SOX2表達(dá)的EC109和EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。
　　4)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染SOX2shRNA病毒的EC109和EC9706細(xì)胞增殖