趨化因子受體CSCR4、CCR7與食管鱗癌生物學行為的臨床研究.pdf

1、研究背景：
　　 中國是食管鱗癌高發(fā)國家，目前外科手術(shù)是胸中段食管鱗癌的主要治療手段，但手術(shù)效果并不理想，5年生存率約為30％～50％，一半以上的患者在手術(shù)后2～3年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，主要的復(fù)發(fā)模式為局部區(qū)域復(fù)發(fā)，其中頸部、鎖骨上及縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占較大比例。盡管目前在食管鱗癌早期診斷及綜合治療方面取得了一定的進步，食管癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)仍是臨床治療所面對的最大難題，直接影響著患者的生存預(yù)后。所以研究食管鱗癌轉(zhuǎn)移的分子生物學機制，對指導(dǎo)

2、食管癌患者選擇治療方案和判定預(yù)后具有重要的臨床價值。
　　 腫瘤的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學特性之一，是一個多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過程，但其具體機制尚未明確。研究證實，腫瘤的轉(zhuǎn)移不是隨意的，而是具有選擇性的，即器官轉(zhuǎn)移特異性。1889年P(guān)eget提出的“種子—土壤”學說(the"seedandsoil"hypothesis)認為，腫瘤的轉(zhuǎn)移是特定的腫瘤細胞（種子）在適宜其生長的器官環(huán)境（土壤）中生長發(fā)展的結(jié)果。1928

3、年Ewing的“解剖或機械”理論（theanatomicalormechanicaltheory）以器官的血液、淋巴引流方向解釋轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而后來在腫瘤特異性轉(zhuǎn)移的研究中出現(xiàn)了新的概念:“歸巢”理論（thehomingtheory）;該理論認為，腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到特定器官是由于不同器官通過趨化作用捕獲或吸引特定類型腫瘤細胞而使腫瘤細胞“歸巢”的結(jié)果。
　　 近年來，化學趨化因子受體—配體信號軸的研究發(fā)現(xiàn)為“歸巢”理論提供了有利的證據(jù)

4、。趨化因子是細胞因子超家族中一類具有化學趨化作用的分泌型小分子蛋白，由70～125個氨基酸組成，分子量8～15kD不等。迄今為止至少已發(fā)現(xiàn)50余種趨化因子及20余種受體。根據(jù)其N末端4個保守半胱氨酸(Cys)殘基的前兩個半胱氨酸殘基的位置，可將趨化因子分為4個亞家族——CXC、CC、C、CX3C亞家族。趨化因子受體是一類介導(dǎo)趨化因子行使功能的GTP蛋白耦聯(lián)的跨膜受體，通常表達于免疫細胞、內(nèi)皮細胞等細胞膜上;7個跨膜區(qū)將分子分成細胞外自由

5、的N端、3個細胞外環(huán)和C端幾個部分。趨化因子與細胞表面的特異性受體結(jié)合后可參與多種生理和病理過程，如細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡、組織損傷、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等。2001年MüllerA首次提出了腫瘤細胞可以利用趨化因子及其受體的特異性結(jié)合實現(xiàn)器官特異性轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞高表達趨化因子受體CXCR4和CCR7，而CXCR4的配體CXCL12多表達于乳腺癌的特異轉(zhuǎn)移部位肺、肝臟、骨髓等，而CCR7的配體CCL21則多表達于淋巴結(jié)組織，從

6、而導(dǎo)致了乳腺癌細胞的定向轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明，趨化因子CXCL12/CXCR4信號軸在腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移中與趨化因子受體CCR7及其配體在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮著愈加重要的作用。
　　 目前，國內(nèi)外對趨化因子與食管鱗癌生物學的研究仍較為少見。本課題應(yīng)用免疫組化檢測、Westernblot及RT-PCR三種方法聯(lián)合檢測趨化因子受體CXCR4與食管鱗癌生物學行為及預(yù)后的相關(guān)性研究;應(yīng)用RT-PCR、免疫組化及Westernbl

7、ot三種方法聯(lián)合檢測趨化因子受體CCR7與VEGF-C在食管鱗癌患者癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達情況，意在探索食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能機制。
　　 目的：
　　 食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生與食管癌細胞的趨化遷移及腫瘤淋巴管生成關(guān)系密切。本文旨在于探討趨化因子受體CXCR4表達與胸中段食管鱗癌生物學行為及預(yù)后的相關(guān)性，以及趨化因子受體CCR7及VEGF-C的表達對食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的影響。
　　 方法：
　　

8、臨床收集2003年6月～2006年6月間山東大學附屬省立醫(yī)院完全切除、臨床資料完整的184例胸中段食管鱗癌患者納入回顧性研究。本組病例無手術(shù)前放/化療者。采用經(jīng)右胸和上腹部二切口食管癌切除、胃食管右胸頂吻合術(shù)（Ivor-Lewis手術(shù)）吻合者132例;采用經(jīng)左胸食管癌切除、胃食管主動脈弓上水平（弓上吻合）吻合者52例。同時收集2009年4月至2009年12月間在山東大學附屬省立醫(yī)院胸外科施行食管癌完全切除加系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃的60例胸中段食

9、管鱗患者的標本，包括食管癌組織、淋巴結(jié)組織及隨即選取的20例癌旁正常食管組織。應(yīng)用免疫組化方法檢測184例胸中段食管鱗癌患者標本中CXCR4蛋白的表達情況，隨訪患者，應(yīng)用Kaplan-Meier法計算生存率，繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存差別，Cox多因素回歸分析判定食管癌患者預(yù)后的獨立危險因素。對60例胸中段食管鱗患者的標本應(yīng)用RT-PCR和Westernblot方法檢測標本中CXCR4表達，應(yīng)用x2檢驗比較CXCR4表達

10、情況的差異，判定CXCR4表達與食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。應(yīng)用RT-PCR方法檢測60例胸中段食管鱗癌患者標本中CCR7mRNA及VEGF-CmRNA的表達;應(yīng)用免疫組化與Westernblot方法檢測CCR7及VEGF-C蛋白的表達情況，D2-40標記淋巴管內(nèi)皮細胞以計數(shù)淋巴管密度(LVD)。應(yīng)用x2檢驗比較CCR7及VEGF-C表達情況的差異，u檢驗比較LVD的差異情況，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)對CCR7和VEGF-C的表達進行相

11、關(guān)性分析，應(yīng)用Logistic多因素回歸分析判定影響食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的獨立相關(guān)危險因素。
　　 結(jié)果：
　　 1.184例患者腫瘤組織中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者CXCR4表達率分別為30.0％，69.6％和82.3％，差異有統(tǒng)計學意義（x2=12.219，P=0.002）;T1、T2和T3患者CXCR4表達率分別為33.3％、64.7％和78.5％，CXCR4表達率差異有統(tǒng)計學意義（x2=12.713，P=0.002）。

12、有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CXCR4表達率分別為82.7％和63.1％，兩組CXCR4表達率差異有統(tǒng)計學意義（x2=8.600，P=0.003）。有、無CXCR4表達患者的5年生存率為26.5％和65.4％，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。T2患者中，有、無CXCR4表達在者5年生存率分別為36.4％和66.7％，兩組差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.075);T3患者中，有、無CXCR4表達組的5年生存率分別為22.1％和57.7％，兩組

13、差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)。pN0患者中，有、無CXCR4表達患者5年生存率分別為38.5％和71.1％，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005);pN1患者中，有、無CXCR4表達組5年生存率分別為14.9％和50.0％，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.048）。Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CXCR4蛋白表達是食管癌患者術(shù)后獨立的預(yù)后危險因素。在60例患者的食管癌組織中，RT-PCR方法檢測有44例(73.3％)

14、CXCR4mRNA，其表達與食管鱗癌的腫瘤浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān);Westernblot方法方法檢測有42例(70.0％)CXCR4蛋白表達陽性，其表達也與食管鱗癌的腫瘤浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。
　　 2.在60例患者的食管鱗癌組織中，RT-PCR方法檢測有46例(76.7％)CCR7mRNA及33例(55.0％)VEGF-CmRNA表達陽性，免疫組化方法檢測有43例(71.7％)CCR7蛋白及29例(48.3％)VEGF-

15、C蛋白表達陽性，Westernblot方法檢測有44例(73.3％)CCR7蛋白及31例(51.6％)VEGF-C蛋白表達陽性。CCR7及VEGF-C在食管癌組織中的表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)明顯相關(guān)(P＜0.05)，而CCR7與VEGF-C的共同表達較單一表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有更為顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。食管鱗癌組織中LVD較正常食管組織中明顯增高(P＜0.05)，且與CCR7、VEGF-C的表達及食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)顯著相關(guān)(P＜

16、0.05)。29例有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中CCR7、VEGF-CmRNA的表達率為86.2％、69.0％，分別高于無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)(22.6％、19.3％)，并與食管癌組織具有高度同源性。三種方法檢測CCR7及VEGF-C在食管鱗癌中的表達明顯高于正常食管組織(P=0.000)。Spearman等級相關(guān)分析表明，在食管鱗癌組織中CCR7表達與VEGF-C表達呈顯著正相關(guān)。Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示:食管鱗癌組織中CCR7陽性表達(OR

17、=12.044，P=0.012)，VEGF-C陽性表達(OR=5.976，P=0.015)及腫瘤浸潤(OR=0.110，P=0.012)是影響胸中段食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的獨立危險因素。
　　 結(jié)論：
　　 CXCR4在食管鱗癌組織表達隨腫瘤的浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而明顯增高，CXCR4表達的胸中段食管鱗癌患者預(yù)后不良，CXCR4表達是判定食管鱗癌患者預(yù)后不良的一種指標。CCR7及VEGF-C在食管鱗癌患者的食管癌組織及淋