LSD1在食管鱗癌中表達(dá)及對(duì)腫瘤部分生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景
　　組蛋白共價(jià)修飾是一種重要的表觀遺傳模式，包括組蛋白乙?；?、甲基化、磷酸化以及泛素化等，其中乙?；c甲基化是目前研究比較多的組蛋白修飾方式。2004年Shi等人的研究組發(fā)現(xiàn)賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶(Lysine specific demethylase1，LSD1)，打破了以往認(rèn)為組蛋白甲基化不可逆的觀點(diǎn)。
　　在LSD1催化去甲基化反應(yīng)的過程中，不同的分子伴侶可以介導(dǎo)LSD1作用于不同的底物，從而產(chǎn)生不同的

2、生物學(xué)效應(yīng)。LSD1通過阻遏元素沉默轉(zhuǎn)錄因子輔阻遏物(Co-repressor of the repressor element silencing transcription factor，CoREST)復(fù)合體與靶基因結(jié)合時(shí)，可以使組蛋白H3上第4位賴氨酸(Lysine，K) H3K4去甲基化，該過程與染色質(zhì)濃縮及轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)，此時(shí)LSD1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制基因的表達(dá)。LSD1與雄激素受體(Androgen Receptor，AR)

3、或者雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)結(jié)合后，可以特異性的催化組蛋白H3上第位賴氨酸(H3K9)的去甲基化。H3K9的去甲基化與染色質(zhì)的開放構(gòu)象和基因表達(dá)相關(guān)，此時(shí)AR/ER依賴的基因表達(dá)上調(diào)，LSD1促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活。
　　近年來多項(xiàng)功能研究發(fā)現(xiàn)LSD1通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、胚胎分化、異染色質(zhì)的形成、細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化狀態(tài)的合理維持以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem

4、cell，iPS cell)形成等多方面起到重要作用。前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌、乳腺癌以及血液系統(tǒng)腫瘤等方面，普遍發(fā)現(xiàn)LSD1的高表達(dá)，通過敲除LSD1或抑制LSD1作用后，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。另外，目前已經(jīng)有多種組蛋白修飾酶抑制劑用于腫瘤的治療，如組蛋白去乙?；敢种苿?Inhibitors of histone deacetylases，HDACi)，而LSD1抑制劑也有望成為抗腫瘤藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)。深刻認(rèn)識(shí)并揭示LSD1

5、的作用機(jī)制和組蛋白甲基化與去甲基化動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制，對(duì)于腫瘤防治藥物的開發(fā)具有重要意義。
　　食管癌是世界第八大腫瘤，其發(fā)生具有明顯的地域性，亞洲地區(qū)是食管癌高發(fā)區(qū)之一。早期食管癌患者手術(shù)治療后5年生存率高，隨著食管癌的進(jìn)展，中晚期食管癌患者預(yù)后不良，尤其是伴有轉(zhuǎn)移的患者。同時(shí)由于食管癌的早期檢出率偏低，嚴(yán)重影響了該病的治療效果。前期研究發(fā)現(xiàn)，如同其他大部分惡性腫瘤一樣，食管癌的發(fā)生和發(fā)展經(jīng)歷了遺傳物質(zhì)及表觀遺傳修飾的雙重突變，而表觀

6、遺傳修飾的可逆性也昭示著食管癌預(yù)防和有效治療的可能性。LSD1在食管癌中的表達(dá)和作用機(jī)制目前仍不明確，本研究試闡明LSD1在食管癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到的作用，為食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的深入探討以及臨床診斷和治療奠定初步基礎(chǔ)。
　　研究目的
　　本研究通過對(duì)食管癌組織及其組織芯片，食管癌癌前病變以及正常食管黏膜中LSD1表達(dá)情況的研究，揭示LSD1表達(dá)量與食管癌惡性程度、浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)性質(zhì)的關(guān)系，推測(cè)LSD1的表達(dá)與食管

7、癌患者預(yù)后的可能關(guān)聯(lián)。同時(shí)通過檢測(cè)及干預(yù)食管癌細(xì)胞株內(nèi)LSD1的表達(dá)和作用，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移能力變化，進(jìn)一步探討LSD1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中起到的可能作用，從而為食管癌的預(yù)防和治療提供新的方案。
　　研究方法
　　一、組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn):探討LSD1在不同臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)及意義
　　實(shí)驗(yàn)分組:正常食管黏膜組織、食管癌癌前病變組織（上皮內(nèi)瘤變及不典型增生等）及其人食管鱗癌組織三組。
　　實(shí)驗(yàn)步驟:制

8、作組織蠟塊及組織芯片，HE染色明確臨床診斷。免疫組化染色，檢測(cè)上述組織中LSD1和腫瘤增殖抗原Ki67的表達(dá)情況，TUNEL檢測(cè)食管癌組織芯片中細(xì)胞凋亡情況，由兩位病理醫(yī)師根據(jù)免疫反應(yīng)積分打分法(Immnohistochemicalsemi-quantitative Remmele scoring system，IRS)對(duì)染色結(jié)果分別進(jìn)行評(píng)分，即:免疫組化染色的評(píng)分同時(shí)考慮免疫反應(yīng)染色強(qiáng)度(staining intensity，SI)和

9、陽性細(xì)胞百分比(positive percent，PP)。SI分值:0分為未見陽性細(xì)胞，1分為細(xì)胞陽性染色最強(qiáng)處呈現(xiàn)弱陽性，2分為陽性，3分為可見強(qiáng)陽性染色的細(xì)胞;PP分為5級(jí):0分為無染色陽性區(qū)域，1分為陽性染色區(qū)域≤10％，2分為陽性區(qū)域介于11％～50％，3分51％～80％，當(dāng)陽性染色區(qū)域＞80％時(shí)為4分。IHC得分=SI×PP。最后按得分將結(jié)果區(qū)分為陰性表達(dá)、高表達(dá)與低表達(dá)三組:陰性即最終積分為0，低表達(dá)即0＜積分≤4分，評(píng)分＞

10、4分為高表達(dá)。
　　經(jīng)過對(duì)食管鱗癌患者術(shù)后的隨訪，獲取患者基本資料、相關(guān)臨床治療方案及預(yù)后信息。分析LSD1表達(dá)量與食管癌患者病例資料及預(yù)后信息的關(guān)系，探討LSD1表達(dá)與細(xì)胞增殖及凋亡的關(guān)系。
　　二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):探討LSD1表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞株部分生物學(xué)行為的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)食管癌細(xì)胞株的不同，分為KYSE150、KYSE450以及EC109三組。
　　實(shí)驗(yàn)步驟:使用Western Blot及RT-PCR檢

11、測(cè)LSD1在不同食管癌細(xì)胞株內(nèi)的蛋白和RNA表達(dá)水平。Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞株在不同LSD1表達(dá)水平時(shí)的侵襲及運(yùn)動(dòng)能力。
　　三、干擾實(shí)驗(yàn):敲除LSD1的表達(dá)或抑制LSD1的作用，觀察食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的改變
　　1.慢病毒穩(wěn)定敲除食管癌細(xì)胞株KYSE450中LSD1的表達(dá)，根據(jù)敲除程度的不同分為兩組，同時(shí)轉(zhuǎn)染無敲除能力的慢病毒作為對(duì)照組。以綠色熒光蛋白(GFP)的穩(wěn)定表達(dá)作為慢病毒轉(zhuǎn)染成功的標(biāo)志。<

12、br>　　實(shí)驗(yàn)分組:慢病毒敲除組1(KD1)，慢病毒敲除組2(KD2)以及空載慢病毒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組（Negative Control）。
　　實(shí)驗(yàn)步驟:構(gòu)建慢病毒敲除食管癌細(xì)胞株內(nèi)LSD1的表達(dá)并用Western Blot及RT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。檢測(cè)食管癌細(xì)胞株經(jīng)LSD1敲除后，侵襲及運(yùn)動(dòng)能力的改變。分析細(xì)胞生物學(xué)行為的改變與LSD1表達(dá)的關(guān)系。
　　2.LSD1抑制劑tranylcypromine以不同濃度作用于食管癌

13、細(xì)胞株KYSE450，抑制LSD1的去甲基化作用，檢測(cè)細(xì)胞株內(nèi)蛋白表達(dá)并觀察細(xì)胞株生物行為的改變。
　　實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)LSD1抑制劑濃度的不同進(jìn)行分組，最終作用濃度:0uM（對(duì)照），50uM以及250uM。
　　實(shí)驗(yàn)步驟:以tranylcypromine不同濃度作用于KYSE450細(xì)胞株，培養(yǎng)24h后提取細(xì)胞株蛋白。以WB的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LSD1、H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1以及K3K9me2的表達(dá)，確定L

14、SD1在食管癌細(xì)胞株KYSE450內(nèi)可能的作用位點(diǎn)。同時(shí)，采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)抑制劑不同作用濃度時(shí)，細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的變化。
　　研究結(jié)果
　　1.獲取正常食管組織29例，食管癌癌前病變組織23例及食管癌組織134例。免疫組化檢測(cè)LSD1情況，發(fā)現(xiàn)LSD1在51.7％的正常上皮組織基底部有少量表達(dá);在癌前病變組織內(nèi)表達(dá)陽性率為73.9％，也均為低表達(dá);腫瘤組織中表達(dá)陽性率為75.4％，其中43.7％的

15、組織內(nèi)LSD1表達(dá)為強(qiáng)陽性。腫瘤組織中LSD1表達(dá)明顯強(qiáng)于正常組織(p＜0.01)及處于癌前病變期的食管黏膜組織(p＜0.01)。
　　2.LSD1表達(dá)與患者的性別、年齡等基本臨床資料無相關(guān)性，與腫瘤的生長(zhǎng)類型、分化程度以及浸潤(rùn)深度等病理資料也無明顯相關(guān)。但LSD1表達(dá)高低與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(p＜0.05)，且明顯影響患者的生存期，LSD1高表達(dá)的患者預(yù)后明顯差于LSD1低表達(dá)組(p＜0.01)。
　　3.LSD1表達(dá)

16、與Ki67均表達(dá)在增殖能力比較強(qiáng)的正常食管上皮基底部，且在食管癌組織中LSD1的表達(dá)與Ki67具有顯著相關(guān)性(p＜0.01)，LSD1高表達(dá)時(shí)Ki67的表達(dá)也明顯增多。LSD1表達(dá)與食管癌腫瘤細(xì)胞凋亡無顯著相關(guān)性，在食管癌組織切片中凋亡細(xì)胞很少，無論LSD1表達(dá)高或者低。
　　4.食管癌細(xì)胞株KYSE450，KYSE150及EC109內(nèi)，LSD1表達(dá)量不同，其中KYSE450及KYSE150細(xì)胞株內(nèi)LSD1表達(dá)水平明顯高于EC10

17、9細(xì)胞(p＜0.01)。
　　5.劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)KYSE450及KYSE150細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力均較EC109細(xì)胞強(qiáng)(p＜0.01)。
　　6.慢病毒轉(zhuǎn)染敲除KSE450細(xì)胞內(nèi)LSD1的表達(dá)后，得到兩株敲除水平不同的KYSE450細(xì)胞，與對(duì)照細(xì)胞比，敲除LSD1的KYSE450細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力明顯降低，且與LSD1表達(dá)水平有關(guān)。
　　7.LSD1抑制劑tranylcypromine作用于K

18、YSE450細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)H3K4me1表達(dá)量隨作用濃度增高而降低，H3K4me2隨作用濃度增高而增高，H3K9甲基化水平未出現(xiàn)明顯變化。
　　8.Tranylcypromine可以明顯抑制KYSE450細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，且抑制強(qiáng)度隨藥物作用濃度的升高而增加。
　　研究結(jié)論
　　1.LSD1在食管癌中表達(dá)明顯高于正常食管組織及食管癌癌前病變組織，且LSD1的表達(dá)增多與食管癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并能影響患者預(yù)后。L

19、SD1表達(dá)增多與Ki67表達(dá)增多正相關(guān)，可能與食管癌的增殖能力有關(guān)，但與食管癌細(xì)胞凋亡無關(guān)。
　　2.不同食管癌細(xì)胞株表達(dá)LSD1的水平不同，其中侵襲和運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)的KYSE450和KYS150細(xì)胞株中LSD1表達(dá)較高。
　　3.慢病毒敲除KYSE450中LSD1的表達(dá)后，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力明顯下降。LSD1抑制劑Tranylcypromine處理KYSE450細(xì)胞，可以明顯抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)發(fā)現(xiàn)H3K4的甲基化狀態(tài)