CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、背景:
　　子宮平滑肌肉瘤(uterine leiomyosarcoma，ULMS)是臨床上發(fā)病率較低的婦科惡性腫瘤，但它是子宮體最常見的肉瘤之一，占子宮全部惡性腫瘤的1.5％，約占子宮肉瘤的40％。其特點(diǎn)為轉(zhuǎn)移發(fā)生早，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶亞基2(cyclin-dependent kinase subunit，CKS2)是廣泛分布于真核生物細(xì)胞中的小分子蛋白，在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育、減數(shù)分裂和體細(xì)胞分裂中起重要

2、作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，CKS2在結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中都存在過(guò)度表達(dá)的情況，并對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，但關(guān)于CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的研究尚未見報(bào)道。本研究主要探討子宮平滑肌肉瘤中CKS2的表達(dá)情況及其臨床意義，并探究CKS2在子宮平滑肌肉瘤細(xì)胞中的作用及其作用機(jī)制。
　　第一部分 CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義
　　方法:
　　1.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院和山東省立醫(yī)院2005年-2

3、015年之間38例子宮平滑肌肉瘤病例以及對(duì)照組38例子宮平滑肌瘤，完善病例臨床資料。
　　2.利用免疫組化方法檢測(cè)子宮平滑肌肉瘤組和子宮平滑肌瘤組中CKS2蛋白的表達(dá)情況，并將免疫組化結(jié)果根據(jù)Formwitz評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。
　　3.根據(jù)兩組免疫組化評(píng)分結(jié)果，比較子宮平滑肌肉瘤組和子宮平滑肌瘤組中CKS2蛋白表達(dá)情況的差異;將子宮平滑肌肉瘤分為高表達(dá)組（≥4分）和低表達(dá)組（＜4分），統(tǒng)計(jì)分析CKS2蛋白的表達(dá)水平與子宮平滑

4、肌肉瘤患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.CKS2在子宮平滑肌肉瘤和子宮平滑肌瘤中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核中。CKS2在子宮平滑肌肉瘤中高表達(dá)率為63.2％(24/38)，在平滑肌瘤中高表達(dá)率為18.4％(7/38)。與子宮平滑肌瘤相比，CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。
　　2.統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CKS2高表達(dá)組的腫瘤體積更大(p=0.014)，孕激素受體的表

5、達(dá)水平下調(diào)(p=0.048)，CKS2的表達(dá)與患者年齡、FIGO分期、雌激素受體表達(dá)水平無(wú)明顯關(guān)系。
　　3.Kaplan—Meier分析顯示在子宮平滑肌肉瘤中CKS2高表達(dá)組的病人預(yù)后比低表達(dá)組差(Log Rank Chi-square=4.735，p＜0.05)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析表明CKS2的過(guò)表達(dá)(Risk ratio，RR=3.124，p=0.036)和FIGO分期是子宮平滑肌肉瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因子(Risk

6、ratio，RR=2.087，p=0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.在子宮平滑肌肉瘤和子宮平滑肌瘤中，CKS2主要定位于細(xì)胞核中。與子宮平滑肌瘤相比，CKS2在子宮平滑肌肉瘤中表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2.在子宮平滑肌肉瘤中，CKS2高表達(dá)組的腫瘤體積更大，孕激素受體的表達(dá)下調(diào)，CKS2的高表達(dá)預(yù)示著較差的預(yù)后。CKS2的表達(dá)和FIGO分期是子宮平滑肌肉瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　第二部分 CKS2對(duì)子宮平滑肌肉瘤細(xì)

7、胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制的研究
　　方法:
　　1.設(shè)計(jì)并合成CKS2特異性的的siRNA，以脂質(zhì)體為介導(dǎo)轉(zhuǎn)染子宮平滑肌肉瘤(ULMS)細(xì)胞株（SK-UT-1和SK-UT-1B），干擾CKS2基因的表達(dá)，并設(shè)立對(duì)照組。
　　2.轉(zhuǎn)染一定時(shí)間后收集試驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤細(xì)胞，提取細(xì)胞中RNA及蛋白質(zhì)，分別利用RT-qPCR和western blot方法檢測(cè)CKS2基因的mRNA的表達(dá)情況和CKS2蛋白的表達(dá)情況，檢測(cè)C

8、KS2的干擾效率。
　　3.利用CCK8方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組0-96h ULMS細(xì)胞增殖情況并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　4.檢測(cè)干擾CKS2后對(duì)ULMS細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的影響:利用Transwell小室和鋪膠小室檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組中ULMS細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)情況。
　　5.檢測(cè)干擾CKS2對(duì)ULMS細(xì)胞平板克隆形成能力的影響:利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組中ULMS細(xì)胞平板克隆形成能力。
　　6.檢測(cè)干擾CKS

9、2對(duì)ULMS細(xì)胞周期的影響:將待測(cè)細(xì)胞用PI染色，利用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組中腫瘤細(xì)胞周期情況，統(tǒng)計(jì)分析兩組的差異。
　　7.檢測(cè)干擾CKS2后對(duì)ULMS細(xì)胞凋亡的影響:將待測(cè)細(xì)胞用AnnexinV-FITC/PI雙染后，利用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組中ULMS細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)分析兩組的差異。
　　8.檢測(cè)干擾CKS2后對(duì)ULMS細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)改變:利用western blot方法檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組中蛋白

10、表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析兩組的差異。
　　結(jié)果:
　　1.SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞在轉(zhuǎn)染sI-CKS2后，CKS2的mRNA和蛋白表達(dá)均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，p＜0.05)。
　　2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明，SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染si-CKS2后48h和24h后增殖能力出現(xiàn)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞在轉(zhuǎn)染si-C

11、KS2后，細(xì)胞遷移及浸潤(rùn)能力均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，p＜0.01)。
　　4.SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞中，si-CKS2轉(zhuǎn)染組克隆形成數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，p＜0.01)。
　　5.SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞在轉(zhuǎn)染si-CKS2后，G1期細(xì)胞比例上升，S期細(xì)胞比例下降，細(xì)胞被阻滯于G1期。
　　6.SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞在轉(zhuǎn)染si-CKS2后，

12、干擾組的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　7.SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞在轉(zhuǎn)染si-CKS2后，cyclin A2表達(dá)下降，claudin1，p-AKT，p-ERK，p-P38和Bax無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論:
　　1.CKS2在SK-UT-1和SK-UT-1B細(xì)胞株中均有表達(dá)。
　　2.CKS2可以促進(jìn)ULMS細(xì)胞的增殖、遷移、浸潤(rùn)和體外平板克隆的形成，促進(jìn)ULM