AMPK活化對腫瘤生物學行為和抗腫瘤治療的作用.pdf

1、背景和目的：全球癌癥死亡人數(shù)正在迅猛上升，癌癥已成為我國五大致死性疾病之首，嚴重威脅著我國人民的健康水平。能量代謝的相對平衡是抑制腫瘤細胞過度生長的預防機制，而腫瘤細胞依靠代謝重組（如 Warburg效應）獲取能量，克服能量供應危機。因此，腫瘤細胞的能量代謝途徑已成為腫瘤治療的潛在靶點。
　　細胞的能量代謝受多條信號通路的調(diào)控，其中單磷酸腺苷激酶（AMPK）信號通路是最重要的途徑，該通路參與調(diào)節(jié)Warburg效應，脂肪酸的合成與谷

2、氨酰胺代謝，并與PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路以及多種轉錄因子有相互作用，共同調(diào)節(jié)細胞的增殖、生長、凋亡等細胞生物學行為，發(fā)揮抑癌作用。腫瘤發(fā)生早期，AMPKα1基因的缺失對癌基因誘發(fā)的腫瘤有促進作用，有臨床病理資料顯示腫瘤組織中AMPK活性低于正常組織，AMPK活性不足被認為是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一。
　　鑒于多種惡性腫瘤組織中AMPK的失活，眾多學者探索如何利用化學或生物分子激活 AMPK以抑制腫瘤生長，并取得

3、良好的效果。例如，二甲雙胍、AICAR、A769662、阿斯匹林、水楊酸，黃蓮素等化學藥物，其中關于降血糖藥物二甲雙胍的研究最為突出，現(xiàn)已作為抗癌輔助用藥進入臨床試驗。除了化學藥物，還發(fā)現(xiàn)一些細胞因子和應激壓力也能激活AMPK。
　　各種因素激活AMPK方式不盡相同，但AMPK的充分激活都有賴于AMPK激酶(AMPKK)的參與，目前已證實的AMPKK包括：LKB1、CaMKKβ、TAK1等。LKB1作為 AMPK最重要的上游激酶，

4、在各種腫瘤組織中表達不一，對二甲雙胍等AMPK激活劑的抗癌效果有重要影響，但目前對于LKB1在應激壓力激活AMPK的作用尚不清楚。此外，前期研究還發(fā)現(xiàn)某些應激壓力（細胞因子刺激或化療藥物）激活AMPK的過程中，并未涉及以上AMPKK。例如，可誘導滲透壓改變的山梨醇。這些應激壓力不僅誘導腫瘤細胞的凋亡，還可以引起AMPK活化，但其具體機制尚不清楚。
　　由此可見，為了提高腫瘤細胞中AMPK的活性，不僅有必要對LKB1-AMPK途徑進

5、行深入研究，還要探索其他的AMPK激活途徑及其在抗腫瘤治療的作用。因此進行了以下研究：⑴胃癌及肺癌組織中的p-AMPK和LKB1的表達情況；⑵LKB1過表達對胃癌細胞SGC-7901生物學行為的影響；⑶ATM和LKB1在抗癌藥物依托泊苷激活AMPK中的作用；⑷AMPK活化是否增加腫瘤細胞對依托泊苷的藥物敏感性；⑸LKB1和MLK3對AMPK的調(diào)節(jié)作用。
　　材料與方法：
　　1.本課題的臨床標本來自南昌大學第一附屬醫(yī)院手術切

6、除標本(倫理批準號2014〔025〕)，收集60例胃癌及其對應癌旁組織，采用免疫組化染色分析檢測胃癌及癌旁組織p-AMPK（Thr172）及LKB1的表達水平；另外，收集了65例不同階段的肺腺癌標本，采用免疫組化染色分析不同階段的肺腺癌組織p-AMPK（Thr172）表達水平；
　　2.在缺乏LKB1蛋白的SGC-7901細胞株中轉入功能性野生型LKB1基因，構建穩(wěn)定表達LKB1的細胞株。以MTT法檢測細胞生長和存活，以細胞劃痕實

7、驗檢測細胞遷移，以流式細胞技術檢測細胞周期、CD44陽性表達細胞比例、細胞凋亡比率；
　　3.依托泊苷以濃度依賴或時間依賴的方式作用于前列腺癌細胞C4-2后，收集蛋白，以免疫印跡法檢測AMPK、ATM磷酸化水平；另外，siRNA干擾C4-2細胞中的ATM或LKB1，再給依托泊苷刺激后，檢測AMPK、ATM的磷酸化水平。
　　4.轉入AMPK DN突變體到C4-2細胞抑制AMPK活化（C4-2 DN），以空載體為對照（C4-2

8、 E），給依托泊苷刺激24小時，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；選擇AMPK活性不同（C4-2 DN及C4-2 E）細胞和LKB1表達不同（A549 E及A549-LKB1）的細胞，給予依托泊苷刺激不同時間后，以免疫印跡法檢測凋亡蛋白表達（Cleaved Caspase3\Cleaved PARP）。
　　5.選擇LKB1表達不同（A549及A549-LKB1）細胞，給予各種應激因子刺激后，以免疫印跡技術檢測p-AMPK與p-JNK

9、，篩選出同時激活AMPK與JNK的因子；在HEK-293T細胞中轉入MLK3質(zhì)粒，后檢測AMPK的磷酸化水平；以GSH純化技術，獲得基因重組蛋白MLK3和AMPK，以體外酶學實驗檢測MLK3對AMPK的磷酸化；在HEK-293T細胞中，轉入MLK3質(zhì)粒后，用GSH beads將GST-MLK3蛋白捕獲，以免疫印跡檢測沉淀中是否捕獲內(nèi)源性AMPKα1或AMPKα2蛋白；將Myc-AMPK?1或?2和GST-MLK3質(zhì)粒共轉染HEK-293

10、T細胞，收集細胞裂解液，與GSH Beads孵育，離心沉淀，收集GSH Beads-MLK3和捕獲的蛋白，以anti-GST和anti-Myc抗體進行免疫印跡分析。
　　結果:
　　1.胃癌及肺癌組織中AMPK和LKB1情況
　　⑴免疫組化結果顯示胃癌組織p-AMPK（Thr172）、LKB1的表達低于癌旁組織(p<0.001)。p-AMPK（Thr172）表達：胃癌中（-）20例，（+）33例，（++）6例，（+++

11、）1例，而癌旁組織中：（-）5例，（+）11例，（++）28例，（+++）16例。LKB1表達：胃癌中（-）23例，（+）25例，（++）12例，（+++）0例，癌旁組織中LKB1表達：（-）9例，（+）13例，（++）27，（+++）11例。
　?、撇煌制诜伟┙M織中的AMPK活化情況，隨著肺腺癌分期的惡性程度增高，p-AMPK（Thr172）表達漸漸下降，Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期(Spearman相關分析=-0.397, p<0.05

12、)。Ⅰ期（-）4例，Ⅰ期（+）5例，Ⅰ期（++）10例，Ⅰ期（+++）3例;Ⅱ期（-）5例，Ⅱ期（+）10例，Ⅱ期（++）9例，Ⅱ期（+++）3例;Ⅲ期（-）9例，Ⅲ期（+）8例，Ⅲ期（++）1例，Ⅲ期（+++）0例。
　　2.提高LKB1蛋白表達對胃癌細胞SGC-7901生物學行為的影響
　　在缺乏LKB1的腫瘤細胞SGC-7901中轉入LKB1基因，增加LKB1的表達可以抑制細胞的增殖與遷移，減少CD44陽性細胞的比例，

13、提高腫瘤細胞對奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶和伊立替康三種抗癌藥物敏感性。
　　3. ATM和LKB1在依托泊苷激活AMPK中的作用
　?、臰estern Blot結果顯示：腫瘤細胞A549受依托泊苷刺激后，p-ATM和p-AMPK（Thr172）逐漸上升，并呈劑量和時間依賴性；
　　⑵siRNA干擾C4-2細胞的ATM表達后，ATM表達下調(diào)，給予依托泊苷刺激細胞，Western Blot結果顯示：p-ATM和p-AMPK（T

14、hr172）無明顯上升；而對照組ATM表達正常，提示依托泊苷刺激可以同時激活ATM和AMPK,依托泊苷激活AMPK過程中需要ATM的參與。
　?、莝iRNA干擾C4-2細胞的LKB1表達，LKB1表達下降，給予依托泊苷刺激細胞，Western Blot結果顯示：p-ATM表達逐漸上升，而無法激活AMPK；而對照組LKB1表達正常，依托泊苷刺激可以同時激活ATM和AMPK。提示在缺乏LKB1的條件下，依托泊苷可以激活ATM，但無法激

15、活AMPK。
　　⑷在缺乏LKB1的A549細胞中，轉入LKB1基因，提高LKB1蛋白表達后，給予依托泊苷刺激細胞，Western Blot結果顯示：可以同時激活ATM和AMPK；而對照組LKB1表達無變化，依托泊苷刺激p-ATM表達逐漸上升，而無法激活AMPK。
　　以上結果提示：依托泊苷激活AMPK過程中需要ATM和LKB1共同參與。
　　4. AMPK活化對腫瘤細胞藥物敏感性的影響
　　⑴流式細胞分析顯示，

16、在依托泊苷刺激下C4-2E細胞（AMPK有活性）凋亡細胞的比例明顯高于C4-2 DN（AMPK無活性）；
　?、埔劳胁窜沾碳ず?，C4-2 E細胞中的p-AMPK（Thr172）表達、Cleaved Caspase3表達和Cleaved PARP表達明顯高于C4-2 DN細胞；
　　⑶依托泊苷刺激下，A549-LKB1細胞的p-AMPK（Thr172）表達、Cleaved Caspase3表達和Cleaved PARP表達明顯

17、高于對照組（A549 E）。
　　結果提示，AMPK活化或提高LKB1表達有助于增強腫瘤細胞的藥物敏感性。
　　5. MLK3對AMPK的調(diào)節(jié)作用
　?、臕549-LKB1和A549-WT細胞受山梨醇、AICAR等7種因子刺激，僅在山梨醇所刺激A549-LKB1和A549-WT兩種細胞后，p-AMPK和p-JNK都升高；提示山梨醇可以同時激活AMPK和JNK,并不依賴于LKB1。
　?、艫549-LKB1和A54

18、9-WT細胞受山梨醇刺激，兩細胞的p-AMPK同時升高，提示山梨醇可能以不依賴LKB1的方式激活AMPK；
　?、窃贖EK293T細胞中轉入MLK3質(zhì)粒，過表達MLK3蛋白，然后以免疫印跡法檢測p-AMPK（Thr172）水平，結果顯示MLK3的異常過表達可提高p-AMPK（Thr172）水平。
　　⑷體外激活AMPK酶學實驗顯示，單獨加入AMP或單獨加入LKB1蛋白對AMPK的磷酸化無明顯影響；同時加入AMP和LKB1可以

19、引起AMPK的磷酸化；單獨加入MLK3可以引起明顯的AMPK磷酸化；同時加入AMP和MLK3引起的AMPK磷酸化最強。該結果提示MLK3可在缺乏AMP的情況下磷酸化AMPK，說明AMPK是MLK3的催化底物。
　　⑸MLK3與AMPK間的相互結合；通過Pulldown技術發(fā)現(xiàn)，轉入GST-MLK3質(zhì)粒的細胞提取物中發(fā)現(xiàn)AMPKα1的表達，提示轉入表達的MLK3蛋白與細胞內(nèi)源性AMPKα1亞單位緊密結合；共轉染Myc-AMPK?1或

20、?2和GST-MLK3入HEK-293T細胞，然后通過IP技術證明，外源性表達GST-MLK3蛋白能與外源性Myc-AMPK?1蛋白發(fā)生特異性結合。
　　結論：
　　1.癌組織中AMPK失活可能是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一，LKB1表達下調(diào)可使AMPK失活。在缺乏LKB1表達的腫瘤細胞中，提高LKB1蛋白表達可以抑制細胞的生長、轉發(fā)移，增強腫瘤細胞的藥物敏感性。
　　2.依托泊苷激活AMPK的過程需要ATM和LKB1共