腫瘤抑制基因RECK對(duì)早孕滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、目的：探討腫瘤抑制基因RECK (the reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs)在正常早孕、足月妊娠、子癇前期絨毛、胎盤的定位及表達(dá)，探討其與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤的關(guān)系。
　　 方法：分別采用免疫組織化學(xué)方法、半定量RT-PCR法、Western blot檢測45例正常妊娠組(早期妊娠組22例、足月妊娠組23例)及42例子癇前期患者(22例輕度子癇前期、20

2、例重度子癇前期)絨毛、胎盤中RECK基因的蛋白定位、表達(dá)和mRNA、蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：(1)免疫組化提示正常妊娠組和子癇前期組均有RECK蛋白表達(dá)，其主要表達(dá)在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)；RECK在正常早孕的具有侵襲力的固定絨毛的細(xì)胞柱上表達(dá)呈弱陽性；正常早孕組絨毛RECK陽性細(xì)胞的平均吸光值明顯低于正常足月妊娠組(P＜0.05)；輕度子癇前期組、重度子癇前期組RECK蛋白表達(dá)均顯著高于正常足月妊娠組(分別

3、P＜0.05，P＜0.01),重度子癇前期RECK平均吸光度比值明顯高于輕度子癇前期組(P＜0.05)；(2)RT-PCR法亦提示正常早孕組絨毛RECKmRNA平均吸光值明顯低于正常足月妊娠組(P＜0.05)，輕度子癇前期組、重度子癇前期組RECK的mRNA水平顯著高于正常足月妊娠組(分別P＜0.05，P＜0.01),重度子癇前期RECKmRNA平均吸光度比值明顯高于輕度子癇前期組(P＜0.05)；(3)Western blot檢測亦顯

4、示在正常早晚孕胎盤組織均有RECK蛋白表達(dá)，妊娠早期RECK蛋白的表達(dá)最低(平均光密度值為0.15±0.02)，足月妊娠時(shí)RECK蛋白表達(dá)(平均光密度值為0.68±0.06)顯著高于早期妊娠(P＜0.05)，輕度子癇前期組、重度子癇前期組中RECK蛋白平均吸光度比值明顯高于正常足月妊娠組(分別P＜0.05，P＜0.01)，重度子癇前期RECK蛋白平均吸光度比值明顯高于輕度子癇前期組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：(1)在正常妊娠

5、中，RECK基因在胎盤組織中的表達(dá)隨孕周增長而增加，足月妊娠的RECK表達(dá)水平明顯高于早孕組，這種變化與正常妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力最強(qiáng)，至妊娠晚期幾乎無浸潤能力的變化相反，提示RECK基因可能參與正常早孕滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕的調(diào)控；(2)與正常足月妊娠比較，RECK在子癇前期胎盤組織表達(dá)更高，在重度子癇前期表達(dá)最高，提示該基因異常表達(dá)升高可能在子癇前期胎盤淺侵蝕中起重要的作用。
　　
　　
　　
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　　 第二部分
　　 RECK基因表達(dá)對(duì)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2活化及細(xì)胞侵襲力影響的研究[目的] 觀察RECK基因過表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系TEV-1的MMP-2活化及細(xì)胞侵襲力的影響。
　　 [方法] (1)以脂質(zhì)體Lipofectamine?

7、2000介導(dǎo)的方法將含RECK全長基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-RECK轉(zhuǎn)染入TEV-1細(xì)胞，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的TEV-1細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分3組，即空白對(duì)照組(TEV-1細(xì)胞)、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3)、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3-RECK)。根據(jù)Invitrogen公司提供的優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TEV-1細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染前TEV-1接種5×105 TEV-1細(xì)胞于6孔板上，待細(xì)胞達(dá)到90％融合時(shí),將含3μ

8、g質(zhì)粒DNA的250μl Opti-MEN和含8μl Lipofect-amine的250μl Opti-MEN輕輕混勻.室溫孵育20 min，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成，加入培養(yǎng)板中，37孵育，轉(zhuǎn)染后24 h換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3和pcDNA3-RECK的細(xì)胞用800μg/mlG418加壓篩選，并用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對(duì)照，逐漸將G418濃度減至200μg/ml維持篩選，16天后可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TEV-1細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR和流式細(xì)胞

9、術(shù)檢測目的基因的表達(dá)；(2)明膠酶譜法、Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測TEV-1細(xì)胞MMP-2活化及細(xì)胞侵襲力變化；(3)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法和細(xì)胞生長曲線法觀察細(xì)胞增殖情況。
　　 [結(jié)果] (1)目的基因在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組TEV-1細(xì)胞mRN和蛋白水平分別有獨(dú)立表達(dá)；(2)明膠酶譜結(jié)果顯示，TEV-1細(xì)胞有MMP-2的基礎(chǔ)活化，正常對(duì)照組與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的MMP-2活化比例分別為0.43±0.12,0.52±0.1

10、4，，二組間差異無顯著性意義；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組MMP-2活化比為0.11±0.04，與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較明顯降低，兩者差異有顯著性意義(P＜0.05)，表明RECK基因表達(dá)上調(diào)可降低MMP-2的活化比例；(3)Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的穿透Matrigel細(xì)胞數(shù)分別為273.8±20.5和287.5±22.1，兩組間無顯著性差異(P＞0.05)；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組穿透Matrigel的細(xì)胞數(shù)為140.2