TGF-β1對(duì)MCF-7趨化因子受體CXCR4、CCR7表達(dá)的影響.pdf

1、【目的】惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性是侵襲和轉(zhuǎn)移，這兩種特性是導(dǎo)致腫瘤死亡的主要原因。目前研究表明，TGF-β和趨化因子及其受體參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，TGF-β與趨化因子及其受體間是否存在關(guān)聯(lián)以及其詳細(xì)機(jī)制尚無報(bào)道。本課題擬探討TGF-β1 對(duì)MCF-7細(xì)胞趨化因子受體CXCR4和CCR7表達(dá)的影響。
　　 【方法和結(jié)果】
　　 一、重組人TGF-β1對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CXCR4

2、、CCR7表達(dá)的影響
　　 用1，10，100ng/ml三種濃度的rhTGF-β1刺激MCF-7細(xì)胞48h后
　　 1．乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CXCR4的表達(dá)
　　 1)mRNA表達(dá)：RT-PCR檢測結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)水平增高；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與未刺激組相比，1ng/ml和10ng/ml的rhTGF-β1能使CXCR4的mRNA表達(dá)水平增加6倍左右，100ng/ml上

3、調(diào)約10倍；
　　 2)蛋白水平的表達(dá)：與空載體對(duì)照組(16.59％)相比，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，用不同濃度rhTGF-β1處理后MCF-7細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)均升高，且呈濃度依賴性的方式上調(diào)CXCR4的表達(dá)，1ng/ml，10ng/ml和100ng/ml刺激組CXCR4的表達(dá)依次為20.67％，24.60％和47.68％；
　　 3)趨化作用：經(jīng)rhTGF-β1刺激后，SDF-1α(CXCR4的配體)對(duì)刺激后的MCF

4、-7趨化作用增強(qiáng)。
　　 2．乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CCR7的表達(dá)
　　 以上處理對(duì)CCR7的表達(dá)無明顯影響。
　　 二、可溶性II型TGF-β受體(Fc:TβRII)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CXCR4、CCR7表達(dá)的影響
　　 (一)可溶性II型TGF-β受體(Fc:TβRII)真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　 1．可溶性II型TGF-β受體(Fc:TβRII)真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　

5、 通過PCR方法從pH2-3FF1(含人TGF-β受體Ⅱ全長序列)擴(kuò)增編碼TGF-β受體Ⅱ胞外功能區(qū)的基因，將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1-hIg 2(含人IgG Fc段)中，命名為pcDNA3.1-TβRII-hIg。經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析證實(shí)，所克隆和構(gòu)建的人TβRII-hIg閱讀框及連接部位序列正確，表明可溶性TGF-β受體Ⅱ胞外段與人IgG Fc融合基因(TβRII-hIg)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　

6、為了方便觀察真核轉(zhuǎn)染是否成功以及轉(zhuǎn)染效率，將融合基因亞克隆至真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析證實(shí)，成功構(gòu)建了含目的基因TβRII-hIg和EGFP的雙表達(dá)載體pIRES2-EGFP-TβRII-hIg。
　　 2．可溶性II型TGF-β受體(Fc:TβRII)真核表達(dá)載體的表達(dá)
　　 采用Lipofectamine TM 2000將pIRES2-EGFP-TβRII-hIg載體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)

7、胞，通過以下方法檢測外源融合基因的表達(dá)
　　 1)利用倒置熒光顯微鏡觀察示蹤蛋白EGFP，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有綠色熒光蛋白的表達(dá)，提示轉(zhuǎn)染成功；
　　 2)RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約1200bp的特異性條帶，與目的片段一致；
　　 3)利用抗人IgG抗體檢測轉(zhuǎn)染目的基因的MCF-7細(xì)胞總蛋白，Western blot結(jié)果顯示分子量約41kD的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致；
　　 4)ELISA檢測

8、MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在Fc:TβRII融合蛋白，并用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)Fc:TβRII進(jìn)行定量檢測。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg的MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)上清中融合蛋白表達(dá)量到第3天約為80ng/ml。
　　 (二)可溶性II型TGF-β受體(Fc:TβRII)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CXCR4、CCR7表達(dá)的影響
　　 將真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-TβRII-hIg轉(zhuǎn)染MC

9、F-7細(xì)胞48h后
　　 1.CXCR4 mRNA的表達(dá)
　　 RT-PCR檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg的MCF-7細(xì)胞CXCR4mRNA的表達(dá)降低；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg細(xì)胞組CXCR4 mRNA的表達(dá)顯著降低，相當(dāng)于pIRES2-EGFP載體組的17％左右。
　　 2.CXCR4蛋白的表達(dá)
　　 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)

10、染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg的MCF-7細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)顯著低于pIRES2-EGFP組，分別為21.45％和31.8％。
　　 3．趨化功能
　　 趨化試驗(yàn)結(jié)果提示分泌性表達(dá)的融合蛋白Fc:TβRII可抑制SDF-1α對(duì)MCF-7細(xì)胞的趨化作用。
　　 4．乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CCR7的表達(dá)
　　 將真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-TβRII-hIg轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h

11、后，對(duì)CCR7的表達(dá)未見明顯影響。
　　 三、CXCR4啟動(dòng)子螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建與順式作用元件的性質(zhì)分析
　　 1．一系列5’ 端截短的CXCR4啟動(dòng)子螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 提取外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA，以其為模板，通過PCR擴(kuò)增一系列5’ 端不同，而3’ 端相同的CXCR4啟動(dòng)子序列，將其克隆入無啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)載體pGL3-basic中。經(jīng)雙酶切鑒

12、定及測序分析證實(shí)，所克隆和構(gòu)建的截短的人CXCR4啟動(dòng)子序列正確，表明構(gòu)建成功。
　　 2．缺失試驗(yàn)分析CXCR4啟動(dòng)子-231bp區(qū)域的順式作用元件
　　 將構(gòu)建的一系列5’ 端截短的CXCR4啟動(dòng)子螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體分別與作為內(nèi)參的pRL-TK(海腎熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體)共轉(zhuǎn)染MCF-7。通過檢測螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的表達(dá)活性，探索CXCR4啟動(dòng)子-231bp區(qū)域順式作用元件的性質(zhì)。結(jié)果提示從

13、hcxcr4啟動(dòng)子上游距離轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)194bp(-194)到-168之間，有發(fā)揮正向調(diào)控的順式作用元件；緊接著有一個(gè)很強(qiáng)的負(fù)向調(diào)控元件存在于-168bp到-160bp之間；從-160bp到-75bp的區(qū)間內(nèi)又有正向調(diào)控的順式作用元件，為進(jìn)一步對(duì)CXCR4表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 【結(jié)論】以上結(jié)果表明，重組人TGF-β1刺激可上調(diào)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CXCR4的表達(dá)；pIRES2-EGFP-TβRII-hI