新城疫病毒基因組生物信息分析及Mukteswar株毒力增強(qiáng)分子機(jī)制研究.pdf

1、新城疫是一種重要的家禽傳染病，該病病原體為新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)，又稱禽副粘病毒1型(Avian paramyxovirus-1，APMV-1)，屬于副粘病毒科Avulavirus病毒屬中的一員。盡管NDV只有一個(gè)血清型，但卻存在多個(gè)基因型。按不同分離株基因組之間的分歧度大小，NDV被分為11個(gè)基因型(Ⅰ-Ⅺ);根據(jù)最新提議的分類標(biāo)準(zhǔn)，該病毒進(jìn)一步被分成16個(gè)基因型(Ⅰ-ⅩⅥ)和更多的基因亞

2、型。作為副粘病毒科一員的NDV其主要進(jìn)化動(dòng)力是來源于RNA依賴性的RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能而造成的RNA復(fù)制錯(cuò)配率高，但也有學(xué)者表示不同分離株之間也會(huì)發(fā)生重組現(xiàn)象，使該病毒能以一種更迅速的方式進(jìn)化。在這兩種進(jìn)化動(dòng)力中，RNA依賴性的RNA聚合酶的高變異率是毋庸置疑的，但是對(duì)于負(fù)鏈RNA病毒來講同源重組似乎并不多見。本研究通過對(duì)NDV基因組一系列的數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析來估測(cè)影響NDV變異的主要進(jìn)化動(dòng)力。另外，根據(jù)不同分離株的毒力差異，

3、NDV又可以分為低毒力、中等毒力和強(qiáng)毒力三種致病型。本研究在全基因組比對(duì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)一株基因Ⅲ型強(qiáng)毒分離株JS/7/05/Ch的基因組與Ⅰ系苗Mukteswar株相似度高達(dá)99％以上，但其毒力卻明顯高于后者，為了探究影響這兩株Ⅲ型NDV毒力差異的關(guān)鍵性基因，本文詳細(xì)比對(duì)了兩株病毒基因組之間的差異，并對(duì)主要差異基因的生物學(xué)意義進(jìn)行了研究。
　　1非自然重組對(duì)新城疫病毒遺傳進(jìn)化分析的影響
　　通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室于2005年到2009年

4、間分離的100多株NDV的F和HN基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，我們并未發(fā)現(xiàn)同源重組事件的存在，但近幾年越來越多的關(guān)于NDV的同源重組的案例被報(bào)道，其中有些基因組甚至發(fā)生多重重組現(xiàn)像。鑒于同源重組在NDV遺傳進(jìn)化過程中所起的作用存在不同的觀點(diǎn)，本研究首先從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載到80條NDV的全基因組序列（2011年4月18日之前釋放的序列）并使用重組分析軟件(RecombinationDetection Program，RDP)進(jìn)行分析。

5、結(jié)果顯示有8條全基因組序列具有重組現(xiàn)象，在這8株預(yù)測(cè)的同源重組子代病毒中有5株病毒發(fā)生了多重重組現(xiàn)象。本研究對(duì)其中的兩條含有重組片段的全基因組序列（China/Guangxi09/2003和NDV/03/018）進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果同樣顯示GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的全基因組序列均含有兩種不同基因型的DNA片段。為確保重組事件的真實(shí)性，我們對(duì)這兩株NDV進(jìn)行空斑純化后重新測(cè)序并再次進(jìn)行重組分析。結(jié)果顯示，新獲得的全基因組并不存在同源重組片

6、段，我們分析認(rèn)為原始數(shù)據(jù)中的重組現(xiàn)象很可能是測(cè)序者對(duì)混合感染的分離樣品或者實(shí)驗(yàn)室污染的樣品測(cè)序時(shí)造成的人為重組事件。為證實(shí)人為重組存在的可能性，我們將兩株不同基因型的NDV進(jìn)行人為混合，然后使用一對(duì)引物對(duì)該混合樣品擴(kuò)增M基因并測(cè)序，結(jié)果表明這對(duì)引物不僅可以擴(kuò)增出兩種不同基因型的M基因片段，而且還可以在同一段PCR產(chǎn)物中同時(shí)擴(kuò)增出兩種基因型的DNA片段。這充分證實(shí)對(duì)NDV基因組進(jìn)行PCR時(shí)Taq酶存在模板轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，導(dǎo)致不同基因型的序列被

7、擴(kuò)增到一起而產(chǎn)生非自然的人為重組現(xiàn)象。以上結(jié)果充分表明GenBank數(shù)據(jù)中NDV全基因組序列中的同源重組并非都是自然重組事件，而這些非自然的人為重組現(xiàn)象會(huì)對(duì)NDV遺傳進(jìn)化動(dòng)力學(xué)分析造成一定的誤導(dǎo)作用。
　　2鴿副粘病毒1型進(jìn)化動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)分析
　　鴿源NDV，又稱鴿副粘病毒1型（pigeon paramyxovirus-1，PPMV-1），是APMV-1的變異分支，20世紀(jì)80年代中期該變異株病毒通過鴿群開始向世界各國(guó)蔓延。雖

8、然PPMV-1的F蛋白裂解位點(diǎn)是典型的強(qiáng)毒類型，但多數(shù)PPMV-1對(duì)雞的致病力卻是中等毒力或低毒力?；谶@個(gè)特點(diǎn)我們推斷PPMV-1應(yīng)該具有其獨(dú)特的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)。遺傳進(jìn)化分析顯示幾乎所有分離于鴿群的NDV均聚攏在同一個(gè)分支——GenotypeⅥb，說明PPMV-1很可能已經(jīng)在鴿群中獲得適應(yīng)性變異導(dǎo)致該分支對(duì)鴿子具有明顯的宿主特異性;與之相對(duì)的是基因Ⅶd型，該分支的NDV卻具有最廣的宿主譜。731株已知宿主來源的NDV的F基因編碼區(qū)序列

9、的遺傳關(guān)系進(jìn)一步的證實(shí)了PPMV-1對(duì)鴿子的特嗜性和基因Ⅶd亞型具有最廣的宿主范圍。通過125株不含重組片段的全基因組序列比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)PPMV-1在整個(gè)基因組水平上與經(jīng)典的APMV-1相比有19個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異。貝葉斯方法估算結(jié)果顯示M基因的年平均進(jìn)化率都高于其他5個(gè)基因，并且通過最近共同祖先分析推斷PPMV-1最早可能出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，要早于有記載的第一株P(guān)PMV-1的分離時(shí)間。適應(yīng)性分析表明雖然PPMV-1的6個(gè)基因均處在負(fù)

10、向選擇的模式下進(jìn)化，但各基因均存在不同數(shù)目的正向選擇位點(diǎn)。PPMV-1的HN基因中的正向選擇位點(diǎn)是6個(gè)基因中最少的，這預(yù)示著該基因受到的宿主免疫壓最小。歷史種群大小重建顯示PPMV-1在其進(jìn)化過程中有兩個(gè)較大的拐點(diǎn)，20世紀(jì)80年代PPMV-1經(jīng)歷爆炸式增長(zhǎng)過程，而到了最近幾年P(guān)PMV-1的種群大小又開始逐漸下降?？傊狙芯拷Y(jié)果顯示PPMV-1已經(jīng)與其主要宿主鴿子形成了相互適應(yīng)的關(guān)系，并推斷其具有相對(duì)獨(dú)特的進(jìn)化特點(diǎn)。
　　3基因

11、Ⅲ型強(qiáng)毒株JS/7/05/Ch與同型Ⅰ系苗Mukteswar株全基因組比對(duì)分析
　　基因Ⅲ型NDV臨床分離株JS/7/05/Ch為典型的強(qiáng)毒，但其基因組卻與Ⅰ系苗Mukteswar株具有99％以上的相似性，據(jù)此我們分析該強(qiáng)毒應(yīng)該由Ⅰ系苗Mukteswar株進(jìn)化而來。本研究分別對(duì)JS/7/05/Ch與Mukteswar兩株NDV分別進(jìn)行空斑純化，并對(duì)得到的四株空斑純化株JS-7122、JS-1217、Muk-4和Muk-5進(jìn)行IVP

12、I值的測(cè)定。結(jié)果顯示JS-7122和JS-1217的IVPI值分別是2.2和2.15，而Muk-4和Muk-5的IVPI值分別為0.03和0.09。為了探索影響Mukteswar株NDV毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵性基因，我們對(duì)JS-7122和Muk-4進(jìn)行全基因組測(cè)序并對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示兩株病毒的差異位點(diǎn)主要集中在NP、HN和L基因上，P、M和F基因則完全一致。NP基因有3個(gè)核苷酸的差異，其中第1433nt變異引起氨基酸位點(diǎn)的變化;H

13、N基因有6個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異并均引起氨基酸的變化;L基因有5個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異，但均未引起氨基酸的突變。通過三維結(jié)構(gòu)模擬可以發(fā)現(xiàn)HN蛋白的4個(gè)差異位點(diǎn)（第19位和29位無法進(jìn)行模擬）均在HN蛋白的表面，并且494和495位的氨基酸正處于HN蛋白的抗原表位site12內(nèi)，我們推測(cè)該基因很可能是導(dǎo)致這兩株Ⅲ型NDV毒力差異主要因素。
　　4 Mukteswar株毒力增強(qiáng)分子機(jī)制研究
　　參照J(rèn)S-7122和Muk-4株NDV的全

14、基因組設(shè)計(jì)8對(duì)引物，經(jīng)RT-PCR方法從兩株Ⅲ型NDV感染的尿囊液中擴(kuò)增得到目的片段。首先將擴(kuò)增的NP、PM依次克隆到pCR2.1載體中構(gòu)建上游中間質(zhì)粒pNPM;然后將MF、FH和HL片段依次克隆到pCR2.1載體中構(gòu)建中游中間質(zhì)粒pMFHL;最后將L1、L2和L3片段依次克隆到pCR2.1載體中構(gòu)建下游中間質(zhì)粒pL123。上、下游中間質(zhì)粒經(jīng)，peⅠ和FspAⅠ酶切后，各自回收目的片段后進(jìn)行連接，獲得中間質(zhì)粒pNPML;將該質(zhì)粒使用Ag

15、eⅠ和FspAⅠ進(jìn)行酶切后，回收目的片段與同樣酶切的pMFHL進(jìn)行連接，獲得兩株Ⅲ型NDV的全長(zhǎng)克隆質(zhì)粒，然后通過特異性酶切反應(yīng)將NDV的基因組全長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到TVT7R(0.0)載體中，成功構(gòu)建兩株Ⅲ型NDV的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒。在上述基礎(chǔ)上，利用AgeⅠ和FspAⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)將兩株Ⅲ型NDV的HN基因進(jìn)行互換，共得到四個(gè)感染性全長(zhǎng)質(zhì)粒，分別是含有母本病毒基因組的TVT/JS-7122、TVT/Muk-4和HN基因互換的感染性質(zhì)粒JS/MH