反向遺傳技術(shù)研究新城疫病毒P基因功能及其對(duì)病毒毒力的影響.pdf

1、新城疫(Newcastledisease，ND)是一種嚴(yán)重的傳染性疾病，能夠感染多種禽類(lèi)，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。測(cè)定了鵝源NDV強(qiáng)毒株ZJ1的全基因組序列，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了該基因組cDNA的全長(zhǎng)克隆以及分別表達(dá)該毒株NP、P以及L蛋白的3個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)病毒的體外包裝技術(shù)，拯救出了具有感染性的病毒粒子，成功建立了鵝源NDV的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)，這也為從病毒生物學(xué)特性的角度研究P基因提供了技術(shù)支持。 1.基因III

2、型和IX型新城疫病毒全基因組測(cè)序及其在新城疫進(jìn)化史中的重要地位分析 根據(jù)EMBL/GenBank中已發(fā)表的基因III型NDV全基因和基因IX型NDV基因片段設(shè)計(jì)一套全基因引物，將NDV全基因分為10個(gè)相互重疊的片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物連入pGEM-Teasy載體測(cè)序后應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。我們測(cè)定了5株基因IX型NDV和2株基因III型全基因組序列并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，雖然兩種基因型毒株

3、同源性較高，但是基因IX型NDVNP基因內(nèi)確實(shí)存在6nt插入片段，基因全長(zhǎng)為15，192nt，是與基因III型NDV不同的毒株。鑒于基因IX型代表株F48E8的分離時(shí)間，可以確定早在上世紀(jì)三、四十年代就已經(jīng)存在全長(zhǎng)15，192nt的毒株。值得注意的是，常用的遺傳進(jìn)化分析以及限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(RE)分析并不能有效的區(qū)分這兩種基因型以及IV型，NP基因5’端非編碼區(qū)核苷酸長(zhǎng)度才是最可靠的遺傳標(biāo)志。最后，根據(jù)兩個(gè)基因型毒株相近的分離時(shí)間和高度

4、的同源性，我們推測(cè)最早有一群NDV毒株在遺傳進(jìn)化過(guò)程中分化為兩支，保持15，186nt基因組長(zhǎng)度的一支演變?yōu)榛騃II型、IV型及相關(guān)毒株；而另外一支，在NP基因5’-NCR插入6個(gè)核苷酸，產(chǎn)生了15，192nt基因組長(zhǎng)度的毒株，可能即為最早的基因IX型毒株，再逐步進(jìn)化演變?yōu)楹髞?lái)的基因V～VIII型。 2.新城疫病毒P/V/W基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域分析及針對(duì)V蛋白C端結(jié)構(gòu)域的抗體制備 根據(jù)EMBL/GenBank上發(fā)布的N

5、DV基因序列，分別設(shè)計(jì)針對(duì)基因II、III、VI和VII型以及classINDV毒株P(guān)基因的引物。RT-PCR擴(kuò)增后測(cè)序，從而獲得5種基因型NDVP基因的正確序列。通過(guò)核苷酸序列預(yù)測(cè)P基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列，并進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腮腺炎病毒屬的猴副流感病毒V型(Simianvirus5，SV5)的V蛋白與NDVV蛋白的氨基酸序列同源性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性均較高，可以將其空間結(jié)構(gòu)作為模板模擬NDVV蛋白以及P蛋

6、白N端的空間結(jié)構(gòu)。綜合各種分析數(shù)據(jù)，可以確定P蛋白輔助N蛋白折疊的結(jié)構(gòu)域位于N端前50aa內(nèi)，其中20aa-29aa預(yù)測(cè)為一個(gè)潛在的疏水性α-螺旋；50aa-131aa結(jié)構(gòu)紊亂；預(yù)測(cè)P蛋白螺旋卷曲結(jié)構(gòu)位于221aa-290aa范圍內(nèi)，可能介導(dǎo)了P蛋白四聚體的形成以及與L蛋白的相互作用：預(yù)測(cè)NDV的X結(jié)構(gòu)域位于291aa-392aa范圍內(nèi)，其中350aa-392aa區(qū)域內(nèi)存在3個(gè)相連的α-螺旋，其二級(jí)結(jié)構(gòu)與副粘病毒X結(jié)構(gòu)域的C端亞單位結(jié)構(gòu)

7、相似，可能介導(dǎo)了P蛋白與衣殼化基因組的相互作用。V蛋白的C端結(jié)構(gòu)域(C-terminaldomain，CTD)的編碼區(qū)域位于P蛋白132aa-239aa區(qū)域內(nèi)，與螺旋卷曲結(jié)構(gòu)部分重疊。最后，根據(jù)分析結(jié)果將基因VII型NDV毒株ZJ1V蛋白CTD的序列插入pGEX-6p-1表達(dá)載體中誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)切膠免疫的方法多次免疫小鼠，結(jié)果獲得抗V蛋白CTD的多抗血清。利用間接免疫熒光鑒定多抗血清與病毒蛋白的反應(yīng)情況，證明制備的抗CTD血清能

8、夠與NDV感染vero細(xì)胞作用，與正常Vero細(xì)胞不反應(yīng)，為后續(xù)的研究工作奠定了基礎(chǔ)。 3.不同基因型新城疫病毒P基因?qū)Σ《径玖Φ挠绊?利用BglII酶切全長(zhǎng)質(zhì)粒pNDV/ZJ1，成功構(gòu)建含有TVT載體、NP基因、P基因以及很少部分M基因和L基因片段的中間質(zhì)粒pTX37。PCR分別分別擴(kuò)增NDV基因II型疫苗株LaSota、基因III型中等毒力株JS/05/9/Go和基因VII型強(qiáng)毒株JS/05/5/Go的P基因，上游引

9、物突變引入SmaI的酶切位點(diǎn)，下游引物突變出ApaI酶切位點(diǎn)。通過(guò)SmaI和ApaI將3株病毒的P基因替換進(jìn)入中間載體pTX37，再利用Bst217I和XbaI將重組質(zhì)粒連入NDV基因組全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒。重組的3種NDV基因組全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒與3個(gè)輔助表達(dá)質(zhì)粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，成功拯救出了P基因替換株RZJ-LP，RZJ-4P，RZJ-IP。通過(guò)MDT、ICPI、IVPI、細(xì)胞致病力以及生長(zhǎng)

10、曲線的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3株P(guān)基因替換株的毒力變現(xiàn)明顯的差異：RZJ-LP和RZJ-4P在細(xì)胞上的生長(zhǎng)滯后于親本病毒ZJ1，細(xì)胞上清中的病毒含量比ZJ1低10倍左右；RZJ-4P和RZJ-LP的ICPI從ZJ1的2.54下降至2.33和1.51；RZJ-IP表現(xiàn)出了比ZJ1更強(qiáng)的感染力，感染細(xì)胞后最早出現(xiàn)病變的時(shí)間和完全破壞單層細(xì)胞的時(shí)間比ZJ1還要早12h-24h。3株P(guān)基因替換株的毒力強(qiáng)弱排序與其P基因來(lái)源毒株的毒力強(qiáng)弱排序相同，表明P基因

11、是影響NDV毒力的因素之一。 4.新城疫病毒P基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域?qū)Σ《旧飳W(xué)活性的影響 通過(guò)SmaI和ApaI的酶切位點(diǎn)，將基因II型疫苗株LaSotaP基因RNA編輯位點(diǎn)上游部分和下游部分分別替換進(jìn)入基因VII型NDVZJ1，成功拯救了具有嵌合P基因的兩株重組病毒RZJ-LaN和RZJ-LaC。通過(guò)PCR在中間質(zhì)粒pTX37的P基因RNA編輯位點(diǎn)后進(jìn)行點(diǎn)突變引入終止密碼子TAG，拯救V蛋白C端結(jié)構(gòu)域缺失株RZJ-VS

12、和熒光標(biāo)記的RZJ-VS/GFP，重組病毒P蛋白的正常表達(dá)不受影響，而由+1GmRNA編碼的V蛋白翻譯到RNA編輯位點(diǎn)后即終止。通過(guò)MDT、ICPI、IVPI、細(xì)胞致病力以及生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RZJ-LaN和RZJ-LaC的毒力比親本病毒稍弱，但明顯強(qiáng)于P基因替換株RZJ-LP，表明上一章中發(fā)現(xiàn)的RZJ-LP毒力大幅度下降是由P蛋白和V蛋白的多個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用的結(jié)果，并非是單個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)е隆Ｔ跊](méi)有干擾素系統(tǒng)的Vero細(xì)胞上RZJ-LP、

13、RZJ-LaN和RZJ-LaC生長(zhǎng)曲線基本重合，而在原代細(xì)胞CEF、GEF上RZJ-LaN的增殖能力最強(qiáng)，RZJ-LaC最弱，RZJ-LaN感染細(xì)胞中病毒的最高含量比RZJ-LP高5～10倍，RZJ-LP比RZJ-LaC高5～10倍，表明ZJ1V蛋白CTD的干擾素拮抗能力強(qiáng)于LaSota。V蛋白缺失株的生物學(xué)活性與相關(guān)報(bào)道完全相反，在細(xì)胞和雞胚中的生長(zhǎng)不受影響，接種Vero、CEF和GEF細(xì)胞以后，細(xì)胞病變以圓縮脫落為主，單層細(xì)胞完全破

14、環(huán)的時(shí)間超過(guò)72h。這種細(xì)胞病變過(guò)程與親本病毒完全不同，暗示V蛋白的CTD結(jié)構(gòu)域應(yīng)該具有未知的功能。檢測(cè)熒光發(fā)現(xiàn)，RZJ-VS/GFP和RZJ/GFP在以0.01MOI接種細(xì)胞后12h都出現(xiàn)了很強(qiáng)的熒光，24h后絕大多數(shù)單層細(xì)胞出現(xiàn)熒光，這表明ZJ1株的復(fù)制和傳播能力非常的強(qiáng)，感染速度超過(guò)了細(xì)胞抗病毒免疫啟動(dòng)的速度，推測(cè)基因VII型NDV高效的增殖和傳播能力也是其免疫逃避的機(jī)制之一 全文小結(jié)： (1)測(cè)定了2株基因III

15、型和5株基因IX型NDV的全基因組序列，證實(shí)兩種基因型毒株雖然同源性較高，但是基因IX型NDV確實(shí)有6nt插入片段，基因全長(zhǎng)為15，192nt，是最早出現(xiàn)的15，192nt基因組長(zhǎng)度毒株。分析后推測(cè)，NDV毒株在遺傳進(jìn)化過(guò)程中分化為兩支，保持15，186nt基因組長(zhǎng)度的一支演變?yōu)榛騃II型、IV型及相關(guān)毒株；而另外一支，在NP基因中插入6個(gè)核苷酸，產(chǎn)生了15，192nt基因組長(zhǎng)度的毒株，可能即為最早的基因IX型毒株，再逐步進(jìn)化演變?yōu)楹?/p>

16、來(lái)的基因V～VIII型。 (2)通過(guò)對(duì)P基因表達(dá)產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析，確定P蛋白和V蛋白結(jié)構(gòu)域的大致位置。 (3)通過(guò)反向遺傳平臺(tái)，替換基因VII型強(qiáng)毒ZJ1的P基因全基因或部分結(jié)構(gòu)域，成功拯救5株重組病毒。3株P(guān)基因替換株的毒力強(qiáng)弱排序與其P基因來(lái)源毒株的毒力強(qiáng)弱排序相同，證實(shí)P基因是影響毒力的因素之一，同時(shí)發(fā)現(xiàn)P基因?qū)Χ玖Φ挠绊懯怯啥鄠€(gè)結(jié)構(gòu)域共同參與，而非單一結(jié)構(gòu)域決定。 (4)利用反向遺傳平臺(tái)，成功拯救2株