應(yīng)用新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)—構(gòu)建L表達(dá)質(zhì)粒.pdf

1、反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system，RGS)就是獲得病毒的基因組序列后，借助于載體構(gòu)建病毒的全長cDNA分子克隆，同時將RNA聚合酶的啟動子元件導(dǎo)入到此分子克隆中，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA，進(jìn)一步去侵染宿主或敏感細(xì)胞系，增殖出大量的與原病毒相似的活病毒，與之相關(guān)的研究技術(shù)稱為反向遺傳學(xué)技術(shù)(Reverse genetics manipulation technique)，也被稱為病毒拯救(Rescueof v

2、irus)。該技術(shù)為研究病毒蛋白功能、基因作用元件提供了方法，也使負(fù)鏈RNA病毒可作為載體表達(dá)外源基因。
　　 新城疫是由新城疫病毒引起的禽類急性傳染病。新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)新城疫樣病毒屬(Avulavirus)。新城疫病毒是不節(jié)段的負(fù)鏈RNA動物病毒，按其致病性的強(qiáng)弱新城疫病毒可分為三類：高致病性(強(qiáng)毒株)、中致病性(中毒株)和低致病

3、性(弱毒株)。NDV LaSota株屬于低致病性的弱毒株，多用作保護(hù)禽類的活疫苗。將NDV LaSota作為疫苗載體，有許多優(yōu)勢，如：可穩(wěn)定表達(dá)外源基因，其與同源的RNA病毒不發(fā)生重組；安全穩(wěn)定，成本低廉；弱毒株對人和動物無致病性；免疫接種途徑簡單；能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫、黏膜免疫及局部免疫等。將NDV LaSota作為疫苗載體有很大的應(yīng)用前景，因而引起研究者更多的關(guān)注。
　　 構(gòu)建含有新城疫病毒全基因組的cDNA分子克

4、隆和含有RNA復(fù)制酶及核蛋白的編碼序列的輔助質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，從而建立新城疫病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，從而實現(xiàn)新城疫病毒的拯救。在新城疫病毒基因組編碼的六種蛋白中，L蛋白是病毒RNA聚合酶，與P蛋白形成具有完整聚合酶活性的復(fù)合物。P蛋白、NP蛋白和L蛋白與病毒基因組結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoproteincomplex，RNP)是啟動NDV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的。所以構(gòu)建編碼L蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒是建立NDV

5、反向遺傳操作系統(tǒng)的基礎(chǔ)。
　　 本試驗通過在vero細(xì)胞中增殖病毒，用Trizol提取病毒RNA，應(yīng)用長鏈RT-PCR法一次性擴(kuò)增出約6.6kb的L基因，進(jìn)一步將其與T-vecter相連亞克隆后，再與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)相連，從而構(gòu)建編碼L蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)RT-PCR、免疫組化檢測和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定以及基因測序認(rèn)定L基因在BHK細(xì)胞中成功表達(dá)，L質(zhì)粒構(gòu)建成功。本研究為建立NDV的反向遺傳操作系統(tǒng)奠定了基