新城疫病毒耐熱株HR09的鑒定與反向遺傳操作系統(tǒng)的構建.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的烈性傳染病—新城疫(Newcastle disease，ND)的病原。由于V4和I-2等耐熱ND弱毒疫苗的貯存和運輸不需要依賴冷鏈，在熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)已經得到廣泛應用。我國上世紀90年代引進了NDV耐熱毒株V4，但由于知識產權等的限制，至今未大規(guī)模應用于生產。本研究從保存的40多株NDV中篩選到1個耐熱強毒株（HR09株）;測定了該毒株的全基因組

2、序列，并分析了其分子生物學特性;建立了該毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)，并對其F基因進行突變，得到NDV耐熱弱毒株。本研究為進一步揭示NDV耐熱毒株的耐熱機制和創(chuàng)制耐熱ND弱毒疫苗奠定了基礎。
　　1.新城疫病毒耐熱株HR09鑒定及全基因組序列測定
　　將本室保存的40多個NDV分離株與V4、LaSota等參考毒株共同進行耐熱性試驗。以56℃耐熱處理30 min時仍具有血凝性作為篩選標準，獲得1個耐熱毒株—HR09株。HR09株經蝕

3、斑純化后進行生物學特性鑒定，顯示該毒株的MDT為57.6 h，ICPI為1.8，IVPI為1.56，符合NDV強毒株特征。
　　設計10對引物，對HR09株全基因組序列進行擴增、測定和生物信息學分析，結果顯示，該毒株基因組全長為15192 nt，推導的F蛋白裂解位點氨基酸序列為112RRQKRF117，HN蛋白長度為571個氨基酸殘基，符合NDV強毒株特征。HR09株基因組GC含量為46.27％，與耐熱的V4株、I-2株全基因組的

4、核苷酸序列同源性為86.7％和85.4％，6個結構蛋白編碼基因的核苷酸序列同源性介于83.1％～95.6％之間、推導的氨基酸序列同源性介于81.6％～98.0％之間。基于F基因全長所構建的進化樹顯示，HR09株屬于基因Ⅷ型毒株。
　　2.新城疫病毒耐熱株HR09反向遺傳操作系統(tǒng)的構建
　　設計了多對引物，構建了HR09株基因組的全長cDNA克隆以及含有該毒株NP、P和L基因的3個真核表達質粒，共轉染BSR-T7/5細胞，拯救

5、出病毒NDV/rHR09。對獲救病毒的耐熱性進行測定，顯示其經56℃處理60 min時仍具有血凝活性，說明NDV/rHR09株與親本株的耐熱性相似。NDV/rHR09株的MDT值為60 h，ICPI值為1.625，仍為NDV強毒株。
　　3.新城疫病毒耐熱弱毒株rAHR09的構建
　　設計兩對引物，經Overlap PCR的方法將NDV/rHR09毒株F基因裂解位點的112、115和117位堿性氧基酸突變成弱毒株特征的非堿性