新城疫病毒反向遺傳操作基礎(chǔ)與應(yīng)用研究.pdf

1、單股負(fù)聯(lián)不分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒(Non-segments negative strand RNA virus，NSNSV)主要包括副粘病毒、彈狀病毒、波納病毒和絲狀病毒，是引起動物和人類傳染性疾病的一群重要疫病原。NSNSV的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過病毒基因組cDNA操作獲得病毒的過程，是90年代后期出現(xiàn)的新型病毒學(xué)技術(shù)，是病毒學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究極為重要的技術(shù)手段和工具平臺。通過反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse

2、 genetic system)對病毒基因組cDNA進(jìn)行突變、缺失或外源基因插入修飾，可獲得相應(yīng)的突變、重組病毒或疫苗株。一、新城疫病毒LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)建立 新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，作為副粘病毒科的重要成員和模型病毒，得到深入研究。重組NDV作為活病毒載體疫苗具有非凡的優(yōu)點：1、NDV弱毒疫苗可同時誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫，其安全有效性已

3、被充分證明；2、NDV遺傳相對穩(wěn)定，僅有一個血清型；3、可通過飲水、噴霧、滴鼻、點眼或注射多種方式給苗，使用極為方便；4、NDV具有高滴度的雞胚生長特性，生產(chǎn)成本極為低廉。我國新城疫疫情復(fù)雜，發(fā)病死亡率高，對養(yǎng)禽業(yè)造成的損失巨大，新生雛雞都要進(jìn)行新城疫免疫。NDV作為活病毒疫苗載體應(yīng)用意義巨大。 本研究以我國自行選育的一株NDV弱毒LaSota疫苗株為載體，建立了相應(yīng)的反向基因操作系統(tǒng)，通過病毒基因組cDNA的操作，成功獲得感染性拯救病

4、毒rLaSota，并構(gòu)建了表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的重組病毒rLaSota-EGFP。研究表明，rLaSota-EGFP保持了野生型LaSota疫苗株高滴度的的雞胚生長特性、對易感雛雞的低致病性及良好的免疫原性，并且雞胚連續(xù)傳代20代次以上保持低致病性和外源基因EGFP的穩(wěn)定表達(dá)不變。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一系列表達(dá)傳染性法氏囊病毒超強(qiáng)毒(very virulenceinfectious bursal disease vi

5、rus，vvIBDV)分離株VP2抗原基因和H5亞型高致病力禽流感病毒(Avian influenza virus)分離株HA抗原基因的重組NDV，并對其生物學(xué)特性、致病性和免疫保護(hù)原性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為研制防制禽類H5高致病力禽流感／傳染性法氏囊病和新城疫的重組二耳關(guān)／多聯(lián)基因工程活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。二、表達(dá)vvlBDV株VP2抗原重組NDV活載體疫苗的構(gòu)建及其生物學(xué)特性和免疫原性研究傳染性法氏囊病毒(Iaffectious Bur

6、sal Disease Virus，IBDV)是危害我國乃至世界養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疫病原。VP2是誘導(dǎo)保護(hù)性IBDV中和抗體的主要免疫原。 本研究成功構(gòu)建了表達(dá)我國傳染性法氏囊病毒超強(qiáng)毒Gx分離株保護(hù)性抗原VP2基因的重組病毒rIaSota-VP2。研究結(jié)果表明，rLaSota-VP2保持野生型LaSota疫苗株對禽類的低致病特性和高滴度的雞胚生長特性，高代次連續(xù)傳代仍然保持生物學(xué)特性和外源重組VP2基因的穩(wěn)定表達(dá)不變。rLa

7、Sota-VP2分別按10<'6>EID<,50>常規(guī)劑量一次免疫7日齡SPF雛雞，可誘導(dǎo)高水平NDV及IBDV特異的保護(hù)性抗體反應(yīng)，免疫雛雞對NDV致死攻擊100％完全保護(hù)；對vvIBDV分離株Gx的致死性攻擊的免疫保護(hù)達(dá)95％以上，并且完全避免IBDV母源抗體對免疫反應(yīng)的干擾，可以提前接種，盡快形成保護(hù)性免疫。重組病毒rLaSota-VP2有望作為安全有效、成本低廉的重組二聯(lián)活疫苗應(yīng)用于傳染性法氏囊病及新城疫的防治。 三、表

8、達(dá)H5亞型重組新城疫病毒活載體疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究 世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的A類傳染病中，包括兩種禽類烈性傳染病，分別為高致病性禽流感和新城疫。高致病性禽流感由H5或H7亞型AIV引起，同時具有極其重要的公共衛(wèi)生意義。采用新城疫弱毒疫苗構(gòu)建防制高致病性禽流感重組病毒活載體疫苗，可以真正實現(xiàn)一種疫苗預(yù)防兩種重大疫病。 A型流感病毒血凝素(HA)是誘導(dǎo)保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)的最主要免疫原。本研究構(gòu)建了表達(dá)A/Goo

9、se／Guangdong／96／1／Ht5N1(GD／96)分離株野生型HA基因和裂解位點堿性氨基酸缺失突變型HA基因、A/BHG／QH／2005／3／H5N1(QH／05)分離株野生型和裂解位點堿性氨基酸缺失突變型HA基因的重組NDV LaSota疫苗株，分別為rLaSota-HAwt(GD)、rLaSota-HAmut(GD)、rLaSota-HAwt(QH)和rLaSota-HAmut(OH)；所有重組NDV均保持野生型LzSot

10、a疫苗株的高滴度雞胚生長和低致病性特性，高代次連續(xù)傳代仍然保持生物學(xué)特性和外源重組HA基因的穩(wěn)定表達(dá)不變。 重組病毒rLaSota-HAmut(GD)和rLaSota-HAmut(QH)分別按10<'6>EID<,50>常規(guī)劑量一次免疫7日齡SPF雛雞，分別誘導(dǎo)顯著而持久的NDV和H5亞型AIV特異保護(hù)性HI抗體反應(yīng)；一次免疫3周后，免疫雛雞對新城疫強(qiáng)毒致死攻擊均為100％完全保護(hù)；對重組HA基因同源和異源H5亞型高致病力AIV

11、的致死攻擊分別形成100％完全保護(hù)，攻毒后不發(fā)病、不死亡且喉頭及泄殖腔排毒檢測陰性。試驗結(jié)果表明，重組病毒rLaSota-HAmut(GD)和rLaSota-HAmut(QH)可以作為安全有效、成本低廉的重組二聯(lián)活疫苗，用于家禽H5亞型高致病力禽流感及新城疫的疫苗防制。 四、重組NDV活載體疫苗作為人類H5禽流感大流行疫苗前瞻性探索研究 新城疫病毒(NDV)為單股負(fù)鏈RNA病毒疫苗，在人類可發(fā)生一過性復(fù)制，NDV已經(jīng)在靈

12、長實驗動物的進(jìn)行安全性和有效性評估。結(jié)果顯示重組NDV是防制重大烈性緊急傳染病極有希望的安全、有效活病毒疫苗載體。 本研究采用已經(jīng)構(gòu)建的表達(dá)H5亞型AIV分離株HA基因的重組新城疫病毒，rLaSota-HAwt(GD)和rLaSota-HAwt(QH)，通過大劑量感染小鼠動物模型，進(jìn)行了安全性和免疫保護(hù)效果的評估。結(jié)果表明，表達(dá)野生型H5亞型AIV分離株HA基因的重組NDV對小鼠具有高度的生物安全性。以表達(dá)HA基因重組病毒rLa

13、sota-HAwt(GD)和rLaSota-HAwt(QH)分別按2×10<'8>EID<,50>經(jīng)腹腔注射途徑接種小鼠，兩次免疫后可誘導(dǎo)顯著的NDV和H5亞型AIV同特異HI抗體和中和抗體反應(yīng)；所有免疫小鼠對重組HA抗原基因同源H5亞型高致病力AIV及抗原偏移異源H5亞型高致病力AIV的致死攻擊均為100％完全保護(hù)，并且完全阻止攻擊病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制。實驗結(jié)果證明了重組NDV活載體疫苗防治H5亞型高致病力禽流感在哺乳動物的有效性，有