基于SERS技術(shù)建立新城疫病毒檢測方法.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種高度接觸性的烈性傳染病。禽類感染NDV后以呼吸道、消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為主要特征。該病呈世界性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。除了強制免疫，對新城疫的定期監(jiān)測是防控該病的另一重要方面，由此也產(chǎn)生了大量的檢測工作。傳統(tǒng)的NDV檢測技術(shù)包括血清學(xué)技術(shù)如HA-HI、ELISA，分子生物技術(shù)如RT-PCR等

2、。然而這些技術(shù)存在著一些不足的地方，如實驗操作步驟較為冗雜、需時較長、價格昂貴、非特異性因素的干擾等。因此亟待建立一種操作簡單、快速、靈敏、無損的高通量檢測方法。表面增強拉曼光譜技術(shù)（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）可使分子的拉曼信號增強1014~1015倍，是一種無損、快速、特異、靈敏的檢測技術(shù)，可以提供明確的分子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)成分信息，為建立病毒檢測方法提供了新的思路。本文結(jié)合拉曼光譜技

3、術(shù)和免疫學(xué)，首次建立SERS新城疫病毒的檢測方法。
　　本研究基于抗原抗體特異性識別并結(jié)合的原理，通過拉曼標(biāo)記的免疫探針溶液檢測新城疫病毒。將新城疫病毒固定在硝酸纖維素膜(Nitrocellulose membranes，NC membranes)上，制備antibody-DSNB-AuNP免疫探針捕捉NC膜上固定的抗原，形成“抗原-免疫探針”半三文治結(jié)構(gòu)復(fù)合物。通過對免疫探針中υs(NO2)拉曼峰的識別，實現(xiàn)對NDV的檢測。本研

4、究探索了試驗實施的條件如積分時間、功率、納米金顆粒規(guī)格、封閉時間和探針孵育時間。測定優(yōu)化條件后檢測方法的特異性、靈敏度，并與常規(guī)檢測NDV方法的優(yōu)點及缺點進行比較。最后評估本研究建立的SERS檢測法的優(yōu)點及缺點。
　　本研究結(jié)果表明，運用SERS檢測NDV的LOD(Limit of detection)值為2 logTCID50，在2 logTCID50~7 logTCID50范圍內(nèi)，υs(NO2)的強度與病毒滴度成線性相關(guān)，線性

5、回歸符合y=397.94x-808.97，相關(guān)系數(shù)R2為0.9859。意味著SERS檢測法能夠在一定范圍內(nèi)實現(xiàn)NDV定性及定量的測定。滴度為7 logTCID50~2 logTCID50的病毒液，其拉曼測試υs(NO2)的強度值，同一滴度組內(nèi)CV（變異系數(shù)，Coefficient of Variation）值分別為5.16％、4.97%、6.40%、11.17%、19.24%、62.23%。應(yīng)用本文建立的SERS檢測法對不同基因型的新城

6、疫毒株進行檢測，均診斷為NDV陽性；而對其他禽類病毒和細(xì)菌的診斷結(jié)果為NDV陰性。整個診斷用時少于2 h。上述數(shù)據(jù)說明本試驗具有較好的穩(wěn)定性、靈敏度和特異性。本試驗條件優(yōu)化結(jié)果為：積分時間4 s、納米金顆粒（60±5）nm、測試功率40 mW、封閉時間45 min、探針孵育時間60 min。SERS檢測法操作簡便、快速，減少了篩查新城疫病毒的工作量。這是國內(nèi)外首次應(yīng)用SERS技術(shù)檢測新城疫病毒的研究，填補了SERS技術(shù)檢測新城疫病毒的空