2011-2015我國部分地區(qū)鴿源新城疫病毒分子流行病學調(diào)查及鴿新城疫疫苗VIb-I4的免疫效力試驗.pdf

1、鴿新城疫(Newcastle Disease，ND)是由鴿新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一種高度接觸性病毒性傳染病，其臨床表現(xiàn)與雞新城疫非常相似。鴿新城疫于上世紀80年代傳入我國，對我國養(yǎng)鴿業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了巨大威脅。為了解鴿群中NDV的遺傳變異規(guī)律，本文對2011-2015年從我國部分地區(qū)分離的11株鴿NDV進行了遺傳進化分析，并測定了部分毒株的生物學特性。同時為進一步探究鴿源NDV的致病機

2、理并豐富其基因信息庫，本研究選取了不同地點分離到的2株毒力不一致的鴿源NDV進行了全基因組序列的測定和分析。另外，根據(jù)鴿源NDV的分子流行病學研究結(jié)果，針對當前缺少專門用于鴿新城疫預(yù)防疫苗的現(xiàn)狀，本文還對我室研制的鴿新城疫疫苗株VIb-14開展了免疫效力試驗研究。
　　1.鴿源新城疫病毒的分離鑒定及分子流行病學
　　2011-2015年從我國部分地區(qū)發(fā)病鴿的病料中共分離到鴿新城疫病毒11株。F及HN基因序列的遺傳進化分析表明

3、所有分離株均屬基因VIb亞型，證實目前我國鴿群中的ND仍然由VIb亞型NDV引起，該亞型毒株具有明顯的宿主親嗜性。11株鴿源NDV的F及HN基因核苷酸序列的同源性分別是94.3-99.3％和93.9-99.9％，與歐洲近期型毒株(EU/re)處于同一分支。分離株與目前廣泛使用的疫苗株La Sota遺傳距離較遠，11株病毒與La Sota的F及HN基因核苷酸序列同源性分別為83.9-84.9％和82.7-83.6％，氨基酸序列同源性分別為

4、88.4-89.4％和87.4-88.5％。11株NDV的F蛋白裂解位點序列均為112R-R-Q-K-R-F117，呈典型的強毒特征，但這11株病毒的MDT值從50h到114h不等，ICPI從0.98到1.51不等，說明毒株間的毒力差異較大，因此F蛋白裂解位點序列并不是新城疫病毒
　　毒力的唯一決定因素。分離株與La Sota相比在HN蛋白抗原區(qū)及附近位點存在12個氨基酸位點差異，其中4個為保守性替換，其余分別涉及極性，電荷，結(jié)構(gòu)

5、的改變。第347位氨基酸位于HN蛋白的線性抗原表位，分離株與La Sota相比在該位點發(fā)生了E347G-的替換，并且單抗6B1與分離株反應(yīng)的HI效價也比其與La Sota低6個滴度。病毒中和試驗結(jié)果顯示，分離株NT-23-11-Pi與La Sota的抗原相似系數(shù)R值為0.42，證明兩者間存在顯著的抗原性差異。
　　對分離自不同地區(qū)且毒力有差異的NT-23-11-Pi及ZJ-08-13-Pi進行全基因組序列測定，結(jié)果表明兩株病毒基因

6、組全長為15192nt,遺傳進化分析表明兩株病毒處于EU/re這個分支。兩株病毒NP、P、M、F、HN、L蛋白氨基酸序列的同源性分別為為99％、97％、99.5％、98.6％、99.5％和99.6％，共有25個氨基酸差異位點涉及到極性及結(jié)構(gòu)的變化，這些位點為VIb亞型NDV毒力分子機制的研究提供了有益參考。
　　2.鴿新城疫滅活疫苗VIb-14的免疫效力試驗
　　目前我國對新城疫的防控主要依靠免疫接種，但目前我國尚無針對鴿新

7、城疫的疫苗產(chǎn)品。前期，本室利用反向遺技術(shù)成功研制出了專用于鴿新城疫預(yù)防的滅活疫苗VIb-14，為了加速該疫苗的產(chǎn)業(yè)化，本文對其開展了鴿新城疫滅活疫苗(VIb-14)免疫效力試驗研究。首先將疫苗株VIb-14在雞胚上連續(xù)傳15代，測定第1、5、10、15代次病毒的毒力和F蛋白裂解位點的氨基酸序列，數(shù)據(jù)顯示疫苗株VIb-14經(jīng)雞胚連續(xù)傳代后，其毒力測定指標和F蛋白裂解位點序列均符合典型的弱毒特征，表明疫苗株具有良好的遺傳穩(wěn)定性;同時疫苗毒株

8、在雞胚上具有較強的繁殖性能，疫苗毒尿囊液的HA效價≧91og2，病毒含量高于109.0EID50/0.1ml。在生物學特性測定的基礎(chǔ)上，我們選取了4株VIb亞型NDV分離株對鴿進行致病性實驗，并從中篩選獲得了用于疫苗效力試驗的檢驗強毒株NT-23-11-Pi，該毒株以106EID50的劑量攻毒時可導致非免疫鴿產(chǎn)生80％的死亡率，試驗鴿在攻毒后的第15天仍可檢測到排毒。最小免疫劑量試驗結(jié)果表明VIb-14滅活疫苗的最小免疫為200μl，以