犬蝠源呼腸孤病毒的分離鑒定及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、本文將30份廣東省韶關(guān)市送檢的野生犬蝠樣品，研磨后接種Vero-E6細(xì)胞，從中分離到2株病毒。其中一株在Vero-E6細(xì)胞上盲傳至第4代開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞收縮、變圓，最后細(xì)胞從瓶壁脫落。反復(fù)凍融3次后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病毒粒子無囊膜，有雙層衣殼，呈正二十面體對(duì)稱，將病毒命名為Bat/China/2003(B/03)。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)表明該病毒能凝集健康人O型血紅細(xì)胞，不能凝集SPF雞、實(shí)驗(yàn)用普通級(jí)

2、牛、大鼠和豚鼠的紅細(xì)胞。理化特性試驗(yàn)表明該病毒對(duì)氯仿有抵抗力；能耐受pH3.0的酸性環(huán)境；50℃水浴1h病毒喪失感染能力；1MMgcl2能提高病毒對(duì)熱的抵抗力，增強(qiáng)病毒的活性。病毒基因組經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分大、中、小3個(gè)區(qū)段。用哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(mammalianorthoreovirus，MRV)特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)

3、，擴(kuò)增得到了預(yù)期大小的片段。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBIBLAST分析表明，與呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬的Ndellevirus(NDEV)核苷酸同源性最高為91.2％。用DNAMANMultipleAlignment進(jìn)行序列同源性分析，與MRV血清1、2、3型的代表株T1L、T2J、T3D的核苷酸同源性分別為89.9％、76.9％、89.9％。以上結(jié)果證明該病毒為呼腸孤病毒科的成員。 采用RT-PCR方法，測(cè)定犬蝠源呼腸孤病毒B/03株

4、全基因組10個(gè)基因節(jié)段完整ORF序列。使用分子生物學(xué)軟件對(duì)其核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹，并分析各基因編碼產(chǎn)物的功能區(qū)與結(jié)構(gòu)域，從而預(yù)測(cè)各蛋白的功能。根據(jù)B/03株編碼的蛋白和呼腸孤病毒科其它成員編碼蛋白的比較結(jié)果推測(cè)，B/03株的L1、L2、L3、M1、M2、S1、S2、S4基因分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白λ3、λ2、λ1、μ2、μ1、σ1、σ2、σ3，而M3、S1、S3基因編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白μN(yùn)S、σ1S、σNS

5、(S1基因編碼兩種蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白σ1和非結(jié)構(gòu)蛋白σ1S)。 對(duì)功能性結(jié)構(gòu)域的分析表明，λ3蛋白氨基酸序列中含有RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)的保守區(qū)，推測(cè)是病毒的RdRp。λ2蛋白有鳥苷轉(zhuǎn)移酶和甲基化酶的活性區(qū)，推測(cè)可能在病毒復(fù)制時(shí)mRNA的帽化過程中起作用。λ1蛋白的N-末端發(fā)現(xiàn)了鋅指結(jié)構(gòu)和RNA螺旋酶的保守區(qū)，推測(cè)λ1蛋白具有dsRNA連接活性和ATPase活性。μ

6、2蛋白含有兩個(gè)NTP-binding基序，這表明它可能具有核苷三磷酸酶活性。μ1蛋白的C-末端有4個(gè)大的親水區(qū)，都位于蛋白的表面，可能形成環(huán)和折疊，而且抗原性較高，推測(cè)有可能引起宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。σ1蛋白的N-末端有一個(gè)連續(xù)的能形成alpha-helicalcoiledcoils結(jié)構(gòu)的七肽重復(fù)序列(a-b-c-d-e-f-g)n，該區(qū)域可能與病毒的血凝活性有關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，σ1蛋白有4個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，推測(cè)σ1蛋白可能是糖基化的蛋白

7、，與病毒的吸附有關(guān)。σ2蛋白的C-末端有一個(gè)雙親性的α-螺旋，它與大腸桿菌的DNA依賴性RNA聚合酶的β亞基非常相似，推測(cè)具有dsRNA連接活性。σ3蛋白的N-末端有鋅指結(jié)構(gòu)域，C-末端有dsRNA連接區(qū)。μN(yùn)S蛋白的C-末端發(fā)現(xiàn)了七肽重復(fù)序列能形成alpha-helicalcoiledcoils結(jié)構(gòu)，推測(cè)這種結(jié)構(gòu)有利于該蛋白與細(xì)胞骨架的連接。在μN(yùn)S蛋白的N-末端還發(fā)現(xiàn)了ATPase的保守區(qū)，預(yù)示其可能具有ATPase活性。σ1S蛋白

8、富含堿性氨基酸和α-螺旋，有一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，但其功能尚不清楚。σNS蛋白富含Cys殘基和α-螺旋，推測(cè)可能具有ssRNA連接活性。 犬蝠源呼腸孤病毒B/03株L1基因編碼的RdRp與呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬的RdRp同源性較高(91.9％～98.2％)，由此推測(cè)B/03株屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬。B/03株各基因編碼的蛋白與正呼腸孤病毒屬的其他成員進(jìn)行同源性分析的結(jié)果表明，B/03株與MRV氨基酸同源性最高，系統(tǒng)發(fā)

9、生進(jìn)化樹也表明B/03株的各基因與MRV屬于同一個(gè)群。與已報(bào)道的從蝙蝠體內(nèi)分離的正呼腸孤病毒不在同一群。由此可以初步推斷，犬蝠源呼腸孤病毒B/03株屬呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬，哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒。S1基因編碼病毒的型特異性抗原，系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹表明，B/03株的S1基因與MRV血清1型的進(jìn)化關(guān)系最近。但僅據(jù)此推斷B/03株的血清型尚不足夠，還有待于進(jìn)一步的研究。 犬蝠源呼腸孤病毒B/03株各基因的序列比較結(jié)果表明，B/03株