弓形蟲通過STAT3-miR17~92-Bim信號(hào)通路調(diào)控人巨噬細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、背景：弓形蟲是一種人畜共患、廣泛傳播、專性寄生于溫血?jiǎng)游镉泻思?xì)胞內(nèi)的機(jī)會(huì)性致病原蟲。在細(xì)胞內(nèi)寄生的演化過程中，弓形蟲具備了通過多種途徑來抑制凋亡的機(jī)制，使蟲體獲得了繁殖與發(fā)育的充分條件，一方面有利于與蟲體的增值，另一方面也是引起宿主感染的持續(xù)和感染范圍播散的原因。宿主蛋白組定量分析表明，在弓形蟲感染階段，大量的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生了改變。作為研究細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲的模型，弓形蟲從基因水平改變宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的機(jī)制，目前還未見報(bào)道。

2、miRNAs正是具有這種調(diào)節(jié)功能的RNA分子。miRNAs是一種細(xì)胞基因組的自身組分，具有高度的種屬特異性，通過與特定mRNA結(jié)合或調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程來調(diào)控基因表達(dá)。miRNA已經(jīng)成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。在正常狀態(tài)下，miRNAs受到穩(wěn)定的，完整的和平衡的轉(zhuǎn)錄因子、RNA結(jié)合蛋白等網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞環(huán)境的改變非常敏感。蟲體的侵入，作為一種細(xì)胞自身的“異物”，可改變宿主細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，這必然會(huì)引起宿主細(xì)胞 miRNAs表達(dá)水

3、平的改變。
　　目的：觀察弓形蟲感染人巨噬細(xì)胞是否可以改變宿主 miRNA表達(dá)譜；研究與凋亡相關(guān)的miRNA及其靶基因的相互作用及其調(diào)節(jié)；初步揭示弓形蟲通過干擾宿主細(xì)胞基因，調(diào)節(jié)人巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其相關(guān)的信號(hào)通路，為研究寄生蟲-宿主相互作用以及研發(fā)新型藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：利用星狀孢子素誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡途徑，弓形蟲感染后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡。利用Western blotting觀察凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白Bim

4、的表達(dá)。利用高通量人類miRNAs基因芯片和qRT-PCR，分析弓形蟲感染正常人巨噬細(xì)胞后miRNA表達(dá)譜及其改變。通過生物信息學(xué)軟件分析 Bim與miR17~92 miRNAs的關(guān)系及miR17~92基因簇啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄因子 STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。然后利用 Western blotting觀察弓形蟲感染后細(xì)胞內(nèi)STAT3（pSTAT3）的變化。構(gòu)建miR17~92基因簇啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因（pGL3-Basic載體），與表達(dá)S

5、TAT3的表達(dá)質(zhì)粒（pEZ-M02-STAT3-WT, pEZ-M02-STAT3-C）共轉(zhuǎn)染至 MΦ細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)報(bào)告基因活性；構(gòu)建Bim3’-UTRs片段(Bim-3′UTR-1, Bim-3′UTR-2和Bim-3′UTR-3）的熒光素酶報(bào)告基因（pSI-CHECK2載體），與表達(dá) miR-17~92的質(zhì)粒（pEZ-M02-miR-17~92）或 miR-17-5p抑制體及miR-20a抑制體共轉(zhuǎn)染至M細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)報(bào)告基因活性。

6、r>　　結(jié)果：（1）弓形蟲感染的MΦ的早期凋亡率明顯下降；
　?。?）弓形蟲感染后導(dǎo)致MΦ內(nèi)Bim表達(dá)下降；
　?。?）通過miRNA基因芯片分析，弓形蟲感染導(dǎo)致MΦ內(nèi)miR17~92基因簇編碼的miRNA表達(dá)顯著升高；
　?。?）熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR17~92基因簇所編碼的miRNAs通過可結(jié)合Bim3′UTR區(qū)，抑制Bim蛋白的表達(dá)；Western blotting結(jié)果顯示，miR17~92 miRNAs過