自噬紊亂對巨核細胞發(fā)育的影響和機制的研究.pdf

1、自噬是細胞降解部分胞漿，長壽命蛋白質以及細胞器的重要途徑之一。它可以通過重新利用細胞內的組分抵抗外界壓力促進細胞的增殖與分化。自噬在造血干細胞中的缺失能導致多系血細胞的異常分化，許多血液病尤其是血小板相關疾病伴隨著自噬水平的上調，包括特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）和伴隨血小板減少的骨髓異常增生綜合征（MDS）。因此，近年來人們開始重視自噬影響巨核細胞增殖分化和血小板生成的研究工作。為了探究自噬對巨核細胞成熟及血小板生成的調節(jié)作用，我們

2、主要利用了體外自噬調節(jié)劑及動物模型觀察巨核細胞和血小板的變化。
　　目的:
　　探究自噬紊亂對巨核細胞發(fā)育可能造成的影響，影響的具體階段以及發(fā)生機制。
　　方法:
　　我們主要通過利用體外自噬流調節(jié)藥物雷帕霉素（Rap），巴弗洛霉素（BafA）和體內巨核細胞-血小板上自噬基因 Atg7特異性敲除小鼠模型（Atg7flox/flox PF4-Cre）分別造成不同發(fā)育階段的巨核細胞的自噬紊亂和自噬缺失研究自噬對巨核細

3、胞發(fā)育的影響。
　　1.體外研究：首先分別在造血干細胞和成熟的巨核細胞階段加入雷帕霉素（Rap），巴弗洛霉素（BafA）分別成功調節(jié)早期和晚期巨核細胞內自噬的水平，主要通過western blot檢測經典的自噬小體標記物LC3-II的蛋白表達予以確認。然后，結合巨核細胞發(fā)育前、后期不同的特點依次檢測了發(fā)育前期巨核細胞的細胞核、細胞質成熟，代表分化程度的膜蛋白表達，前血小板的形成，血小板的釋放和發(fā)育后期巨核細胞產生前血小板的能力。<

4、br>　　2.體內研究：檢測正常生理情況下Atg7flox/flox PF4-Cre小鼠與其同窩對照小鼠Atg7flox/flox的血小板數(shù)目，巨核細胞的成熟，以及在低劑量X射線輻照誘導條件下，小鼠獲得暫時性血小板減少癥之后的血小板恢復情況。
　　3.機制初步探討：主要運用western blot及Q—PCR的方法檢測調控巨核細胞發(fā)育相關的分子表達，解釋自噬調控巨核細胞發(fā)育的可能機制。
　　結果:
　　我們在原代分離的

5、小鼠胎肝細胞培養(yǎng)基中加入雷帕霉素（Rap）誘導自噬或巴弗洛霉素（BafA）阻礙自噬，我們發(fā)現(xiàn)與溶劑對照組（DMSO）相比自噬被調節(jié)的兩組產生的多倍體巨核細胞數(shù)量明顯減少(Rap54.8±0.6％，BafA50.4±3.8%，Ctrl71.1±2.0%，P<0.05)，同時代表巨核系細胞分化的膜蛋白CD41和CD61表達(Rap1.0±0.1%，BafA0.7±0.0%，Ctrl5.2±0.1%，P<0.001)及血小板釋放(Rap0.4

6、±0.3%，BafA0.7±0.1%，Ctrl8.5±0.5%，P<0.05)均顯著性降低即用雷帕霉素（Rap）或巴弗洛霉素（BafA）處理胎肝細胞能抑制巨核細胞的細胞核的成熟及巨核細胞系的分化。與此同時，我們又檢測了不同處理組誘導的巨核細胞內調控整個造血系統(tǒng)發(fā)育的轉錄因子GATA-1和細胞周期相關蛋白（CyclinD1，CyclinD2以及P21）的表達，我們發(fā)現(xiàn)Rap和BafA處理組的胎肝誘導的巨核細胞中GATA-1(Rap0.56

7、±0.14，P<0.05;BafA0.40±0.06，P<0.01)，CyclinD1(Rap0.44±0.03，P<0.001;BafA0.68±0.06，P<0.01)，CyclinD2(Rap0.25±0.03，P<0.001;BafA0.35±0.02，P<0.05)以及P21(Rap0.04±0.02，P<0.05;BafA0.04±0.02，P<0.05)表達均比對照組(GATA-1:Ctrl1.15±0.13;Cyclin

8、D1: Ctrl1.0±0.07; CyclinD2: Ctrl0.49±0.03; P21: Ctrl0.16±0.03)顯著性降低；接著我們又檢測了磷酸化的肌球蛋白輕鏈（P-MLC），發(fā)現(xiàn)Rap處理組磷酸化水平與對照組相比有顯著性的增高并且該組的巨核細胞的大小也降低，但是我們在BafA處理組中并未發(fā)現(xiàn)MLC磷酸化水平和細胞大小的改變即雷帕霉素或巴弗洛霉素能影響胎肝來源的巨核細胞周期相關蛋白Cyclin D1，CyclinD2以及P2

9、1，轉錄因子GATA-1的表達及MLC的磷酸化水平。
　　然而，我們在巨核細胞純化之后再在其培養(yǎng)基中加入Rap或BafA調節(jié)自噬，發(fā)現(xiàn)前血小板生成未出現(xiàn)異常，這與我們在巨核細胞-血小板自噬基因Atg7特異性敲除小鼠Atg7flox/flox PF4-Cre中觀察得到的正常血小板計數(shù)和巨核細胞成熟的表型相符，同時自噬基因Atg7特異性敲除并不影響小鼠抵抗低劑量的X射線輻照的血小板恢復情況。
　　綜上所述，我們的實驗表明在早期造

10、血干細胞階段對自噬進行干預調節(jié)能抑制巨核細胞發(fā)育及血小板的生成，提示我們該階段可能是治療血小板減少的相關疾病潛在的靶點。
　　結論:
　　在造血干細胞階段上調或者下調自噬能抑制巨核細胞發(fā)育的整個過程，巨核細胞的成熟受抑制會進一步影響血小板的最終生成，自噬對巨核細胞發(fā)育的調控主要通過對轉錄因子GATA-1，細胞周期相關蛋白CyclinD1、CyclinD2、P21以及RhoA下游分子P-MLC的調節(jié)實現(xiàn)的。
　　在成熟的