ITP血漿及脾臟CD8+T細(xì)胞對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育和血小板生成的影響及機(jī)制探討.pdf

1、原發(fā)免疫性血小板減少癥(primaryimmunethrombocytopenia,ITP)是臨床最常見(jiàn)的自身免疫性出血性疾病,約占所有出血性疾病的1/3。以血小板減少、體內(nèi)出現(xiàn)血小板自身抗體、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)正?；蛟龆酁橹饕R床特點(diǎn)。近年來(lái),盡管出現(xiàn)了利妥昔單抗、TPO受體激動(dòng)劑等新的治療方法,但仍有約1/3的患者治療無(wú)效或短期內(nèi)復(fù)發(fā),成為難治性ITP。
　　 本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。長(zhǎng)期以來(lái)由自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生的

2、自身抗體,主要是針對(duì)自身血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和/或(Ⅰ)b/(Ⅰ)X抗原的自身抗體,尤其是IgG抗體對(duì)血小板的破壞被認(rèn)為是ITP的主要病因。血小板的大量破壞本應(yīng)引起血小板生成的代償性增加,但血小板動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)2/3的ITP患者血小板生成減少或生成正常。提示血小板生成減少可能也參與了ITP的發(fā)病。
　　 最近,體外研究顯示ITP患者血漿中的自身抗體能夠抑制巨核細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及成熟,說(shuō)明血小板特異性自身抗體不僅介導(dǎo)外周血小板破

3、壞,還對(duì)骨髓中巨核細(xì)胞有影響。但是多數(shù)ITP患者骨髓中巨核細(xì)胞數(shù)量正常或增多,其血小板生成減少不能用巨核細(xì)胞數(shù)量降低解釋。目前普遍認(rèn)為血小板的生成與巨核細(xì)胞成熟、凋亡密切相關(guān)。因此,巨核細(xì)胞凋亡異常有可能導(dǎo)致ITP患者血小板持續(xù)減少。
　　 隨著對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制的深入研究,細(xì)胞免疫功能失調(diào)在ITP發(fā)病中的作用越來(lái)越受重視。研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血CD8+細(xì)胞增多,CD4+/CD8+下降。Olsson等應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)在ITP

4、患者中與細(xì)胞毒作用有關(guān)的基因以及與Th1細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá)增高,提示細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用可能在ITP發(fā)病中起重要作用。隨后,Olsson等和張峰等的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL,CD8+T)能直接參與對(duì)ITP患者血小板的殺傷,導(dǎo)致血小板持續(xù)破壞。血小板由巨核細(xì)胞凋亡產(chǎn)生,巨核細(xì)胞與血小板表面具有相同的標(biāo)記物,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可能對(duì)巨核細(xì)胞也具有直接的殺傷作用。
　　 我們

5、首先將ITP患者血漿與正常臍血來(lái)源的CD34+細(xì)胞在體外共同孵育,定向擴(kuò)增巨核細(xì)胞,觀察ITP患者血漿對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育和血小板生成的影響。我們還將ITP鼠脾臟CD8+T細(xì)胞與BALB/c小鼠骨髓巨核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞系PU5-1.8細(xì)胞在體外共同孵育,觀察CD8+T細(xì)胞對(duì)巨核細(xì)胞的毒性殺傷作用。
　　 第一部分ITP患者血漿對(duì)體外巨核細(xì)胞發(fā)育和血小板生成的影響及機(jī)制探討
　　 目的:
　　 研究ITP患者血漿對(duì)體外臍血

6、來(lái)源的巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育以及培養(yǎng)體系中血小板生成的影響,探討血漿中抗體以外因素在ITP中的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 ◆采集49例ITP患者血漿以及22例正常對(duì)照血漿。
　　 ◆采集足月妊娠臍血80-100ml,分離單個(gè)核細(xì)胞并從中分選出CD34+細(xì)胞,加入重組人血小板生成素(recombinanthumanthrombopoietin,rhTPO)、重組人白細(xì)胞介素-3(recombinanthumanint

7、erleukin,rhIL-3)、人干細(xì)胞因子(stemcellfactor,SCF)體外培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中,每孔加入100μ(l)正常對(duì)照或ITP患者血漿。
　　 ◆流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞的數(shù)量及凋亡、血小板生成情況以及巨核細(xì)胞中Fas、FasL、TRAIL、TRAIL-R2、Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生成的血小板表面TRAIL的表達(dá)。
　　 ◆酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzym

8、e-linkedimmunoadsorbentassay,ELISA)法檢測(cè)ITP患者/正常對(duì)照血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TPO、IL-11、sFas、sTRAIL水平。
　　 結(jié)果:
　　 ◆多數(shù)ITP患者血漿抑制體外巨核細(xì)胞凋亡,培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞數(shù)目增多而血小板生成減少
　　 細(xì)胞培養(yǎng)第15天,與對(duì)照組血漿孵育下產(chǎn)生的巨核細(xì)胞(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差5.10±0.90×105)相比,26例ITP患者血漿孵育下的CD41a

9、+細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照(7.13±0.86×105,P＜0.0001),定義為A組;14例ITP患者血漿孵育下的CD41a+細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照(2.83±1.02×105;P＜0.0001),定義為B組;另9例ITP患者血漿孵育下的CD41a+細(xì)胞與對(duì)照組無(wú)顯著差異(5.20±0.66×105;P=0.776),定義為C組。
　　 A組巨核細(xì)胞凋亡明顯受抑(21.88％±3.53％),顯著低于對(duì)照組(29.43％±3.80％;P＜

10、0.0001)。而B組(27.36％±4.31％)、C組(28.21％±4.02％)巨核細(xì)胞凋亡與正常對(duì)照組無(wú)差異。
　　 A組(7.51±2.41×103)和B組(7.21±2.45×103)血小板數(shù)目均顯著低于正常對(duì)照(11.21±1.82×103)和C組(10.12±1.91×103)(P＜0.0001)。
　　 ◆在A組ITP患者血漿作用下,體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞中TRAIL,caspase-8以及caspase-3

11、表達(dá)降低
　　 細(xì)胞培養(yǎng)第6天,巨核細(xì)胞中TRAIL,caspase-8以及caspase-3的表達(dá)在各組間無(wú)差異;而在細(xì)胞培養(yǎng)第10和14天時(shí),A組中TRAIL,caspase-8以及caspase-3的表達(dá)顯著低于對(duì)照,B、C組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。另外,A組中TRAIL,caspase-8以及caspase-3的表達(dá)降低與巨核細(xì)胞凋亡減少以及血小板生成減少相關(guān)。
　　 巨核細(xì)胞表面Fas以及FasL的表達(dá)較低,且在各

12、組間無(wú)差異;巨核細(xì)胞表面TRAIL-R2的表達(dá)以及生成的血小板表面TRAIL的表達(dá)均比較穩(wěn)定,且在各組間無(wú)差異。
　　 ◆在A組ITP患者血漿的作用下,體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞中Bcl-xL表達(dá)增高細(xì)胞培養(yǎng)第8天及第15天,A組巨核細(xì)胞中Bcl-xL水平(82.29％±5.02％,72.57％±5.28％)均顯著高于對(duì)照組(51.02％±4.77％,47.34％±5.87％;P＜0.0001)。而另一抗凋亡因子Bcl-2在各組間無(wú)顯著

13、差異。
　　 ◆血漿中IL-11以及TPO水平在各組間無(wú)明顯差異
　　 A組血漿中IL-11水平顯著高于對(duì)照組(126.74±44.23pg/mlvs31.19±9.20pg/ml;P＜0.0001),但I(xiàn)L-11在A、B、C三組ITP血漿間無(wú)顯著性差異。血漿TPO水平在A、B、C三組以及對(duì)照組間無(wú)明顯差異。
　　 ◆A組血漿以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sTRAIL水平降低
　　 血漿中sTRAIL的含量在A組為

14、2343.24±1155.81pg/ml,顯著低于對(duì)照組(5653.37±1583.32pg/ml,P＜0.0001).細(xì)胞培養(yǎng)第6、10、14天時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sTRAIL的含量,A組分別為1200.67±321.49,585.59±277.98,373.65±272.51pg/ml;顯著低于對(duì)照組(2347.18±479.40,1257.13±329.24,852.32±307.32pg/ml,P＜0.0001).B、C兩組上

15、清液中sTRAIL的含量在任何檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組均無(wú)差異。
　　 血漿sFas的含量在各組間無(wú)顯著差異。在細(xì)胞培養(yǎng)第6和10天時(shí),A組培養(yǎng)上清中sFas的含量分別為127.38±18.28和137.72±25.67pg/ml,顯著低于對(duì)照(163.75±23.21;178.68±17.40pg/ml,P＜0.0001).而在第14天時(shí),各組間無(wú)差異。A、B、C三組上清液中sFas的含量在任何檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異。
　　 結(jié)

16、論:
　　 ◆大多數(shù)ITP患者血漿在體外能夠抑制巨核細(xì)胞凋亡,使巨核細(xì)胞數(shù)量增加而血小板生成減少。
　　 ◆巨核細(xì)胞數(shù)量增加并非由于TPO和IL-11的血漿水平升高引起。
　　 ◆凋亡相關(guān)因子TRAIL以及Bcl-xL在巨核細(xì)胞中的異常表達(dá)與巨核細(xì)胞凋亡減少以及血小板生成減少相關(guān)。
　　 第二部分ITP鼠脾臟CD8+T細(xì)胞對(duì)體外巨核細(xì)胞的毒性殺傷作用
　　 目的:
　　 研究ITP鼠脾臟C

17、D8+T細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)的BALB/c小鼠骨髓巨核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞系PU5-1.8細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系EL-4細(xì)胞的毒性殺傷作用,探討細(xì)胞毒性T細(xì)胞直接殺傷巨核細(xì)胞在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法:
　　 ◆提取BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞,加入重組小鼠血小板生成素（recombinantmousethrombopoietin,rmTPO)體外培養(yǎng)7-8天。瑞氏染色觀察小鼠骨髓巨核細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓巨核細(xì)胞表面

18、CD61、H2-Kd的表達(dá)。
　　 ◆體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞系PU5-1.8細(xì)胞和淋巴細(xì)胞系EL-4細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PU5-1.8細(xì)胞和EL-4細(xì)胞表面CD61、H2-Ka/H2-Kb的表達(dá)。
　　 ◆構(gòu)建ITP小鼠模型:野生型BALB/c小鼠血小板或野生型C57BL/6小鼠血小板(100×106)免疫BALB/cCD61KO小鼠,一周一次,連續(xù)免疫2-4周后,檢測(cè)BALB/cCD61KO小鼠血漿中IgG抗體的含量,IgG

19、抗體(1/2000)陽(yáng)性后可取BALB/cCD61KO小鼠脾細(xì)胞,腹腔注射聯(lián)合免疫缺陷鼠(SevereCombinedImmunodeficient,SCID)。每周觀測(cè)SCID鼠血小板數(shù)目,血小板計(jì)數(shù)＜400×109/1,即為ITP模型鼠。
　　 ◆提取ITP鼠脾臟細(xì)胞并從中分選出CD8+T細(xì)胞和/或CD19+B細(xì)胞。
　　 ◆細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):以體外培養(yǎng)的BALB/c小鼠骨髓巨核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞系PU5-1.8細(xì)胞為靶細(xì)胞

20、;以不同種屬血小板(BALB/c血小板或C57BL/6血小板)免疫的ITP鼠脾細(xì)胞(全脾細(xì)胞、去除CD8+T細(xì)胞的脾細(xì)胞、去除CD19+B細(xì)胞的脾細(xì)胞)為效應(yīng)細(xì)胞(對(duì)照組效應(yīng)細(xì)胞為野生型BALB/c小鼠脾細(xì)胞)。將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按照不同的細(xì)胞比例(E∶T=20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1等)在體外共同培養(yǎng)4小時(shí),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨核細(xì)胞的死亡率。
　　 結(jié)果:
　　 ◆體外培養(yǎng)的骨髓巨核細(xì)胞多為成熟多倍體細(xì)胞,表面

21、高表達(dá)CD61、H2-KdBALB/c小鼠骨髓細(xì)胞在含TPO的巨核細(xì)胞培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)7天后,多數(shù)已發(fā)育為成熟多倍體巨核細(xì)胞(N≥4)。絕大多數(shù)巨核細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)CD61和H2-Kd。巨核細(xì)胞表面CD61的表達(dá)率為85.7％,MHCⅠ類分子H2-Ka的表達(dá)率為99.69％。
　　 ◆PU5-1.8細(xì)胞和EL-4細(xì)胞表面高表達(dá)CD61、MHCⅠ類分子H2-Kd或者H2-Kb
　　 對(duì)于PU5-1.8細(xì)胞來(lái)說(shuō),不管其吞噬血

22、小板與否,也不管其吞噬的血小板是否被活化,PU5-1.8細(xì)胞表面均高表達(dá)CD61分子和MHCⅠ類分子(H2-Kd)。部分EL-4細(xì)胞表面也表達(dá)CD61和MHCⅠ類分子H2-Kb。體外培養(yǎng)的EL-4細(xì)胞表面CD61的表達(dá)率為48.87％,MHCⅠ類分子H2-Kb的表達(dá)率為99.33％。
　　 ◆BALB/c小鼠血小板免疫的同種CD61KO鼠脾細(xì)胞(同種免疫組)對(duì)體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞和PU5-1.8細(xì)胞具有殺傷作用,CD8+T細(xì)胞是起

23、主要?dú)饔玫男?yīng)細(xì)胞
　　 BALB/c小鼠血小板免疫的同種CD61KO鼠脾細(xì)胞(同種免疫組)對(duì)體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞和PU5-1.8細(xì)胞均具有明顯的殺傷作用,且此殺傷作用隨E∶T(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞)比值增高而變強(qiáng);而C57BL/6小鼠血小板免疫的BALB/cCD61KO鼠脾細(xì)胞(異種免疫組)對(duì)靶細(xì)胞的作用與對(duì)照組無(wú)明顯差異。進(jìn)一步將同種免疫組脾細(xì)胞中的CD8+T細(xì)胞去除后(CD8+T去除組)發(fā)現(xiàn)其對(duì)PU5-1.8細(xì)胞的殺傷作用明