富血小板血漿對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖及礦化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討不同濃度富血小板血漿(PRP)對(duì)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞（HDPCs）增殖及礦化作用的影響。 方法：⑴HDPCs培養(yǎng)及鑒定：牙髓細(xì)胞來(lái)源于臨床因正畸或阻生而拔除的健康年輕恒牙，采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，并計(jì)算組織塊法培養(yǎng)成功率；觀察HDPCs的生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞波形絲蛋白(Vimentin)及角蛋白(CK)免疫組化染色鑒定細(xì)胞來(lái)源；繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，測(cè)定細(xì)胞倍增時(shí)間；體外連續(xù)培養(yǎng)HDPCs 30d后Von Kossa

2、染色觀察細(xì)胞形成鈣結(jié)節(jié)能力。⑵PRP制備及細(xì)胞增殖檢測(cè)：兩步離心法制備PRP，血常規(guī)分析儀檢測(cè)全血及PRP中血小板濃度，ELISA方法測(cè)定全血及PRP中血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-AB)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)的濃度；采用四唑鹽比色法（MTT）觀察不同濃度的PRP培養(yǎng)HDPCs 2d和4d后細(xì)胞的增殖情況。⑶細(xì)胞礦化能力檢測(cè)：分組培養(yǎng)HDPCs 3d和6d后測(cè)定牙髓細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)8d，

3、12d和16d后上清液骨鈣素(OCN)的含量；連續(xù)培養(yǎng)HDPCs 30d后，采用茜素紅染色的方法來(lái)觀察各組細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)能力，并利用Photoshop軟件測(cè)定各組鈣化結(jié)節(jié)的面積。 結(jié)果：①本實(shí)驗(yàn)組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞成功率為40％；免疫組化染色顯示 Vimentin染色陽(yáng)性，CK染色為陰性，提示細(xì)胞來(lái)源于中胚層；體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞增殖較快，細(xì)胞倍增時(shí)間為44.42h，連續(xù)培養(yǎng)HDPCs 30d后細(xì)胞能形成礦化結(jié)節(jié)，Vonkos

4、sa染色呈陽(yáng)性。②兩步離心法制備的PRP中血小板的濃度大于1000×109個(gè)/L，為全血中的4倍以上，經(jīng)ELISA的方法測(cè)定PRP中PDGF-AB和TGF-β1的濃度亦為全血的4倍以上。MTT法測(cè)定不同濃度組的PRP對(duì)HDPCs均有促進(jìn)增殖作用，以10％PRP增殖效應(yīng)最明顯，4d時(shí)PRP對(duì)細(xì)胞的增殖作用明顯強(qiáng)于2d時(shí)，10％PRP組較10％胎牛血清組增殖作用明顯。③加入不同濃度的PRP培養(yǎng)HDPCs 3d和6d后，牙髓細(xì)胞ALP活性明顯

5、降低，P<0.05；在DMEM中加入10％PRP培養(yǎng)8d，12d及16d后，細(xì)胞OCN濃度與DMEM組相比差異無(wú)顯著性，而在10％FBS中加入10％PRP培養(yǎng)8d、12d及16d后OCN含量明顯下降，P<0.05；實(shí)驗(yàn)組中加入10％PRP連續(xù)培養(yǎng)30d后，與對(duì)照組（10％FBS）相比礦化結(jié)節(jié)面積減小，差異具有顯著性。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)的HDPCs具有較好的體外增殖及形成礦化結(jié)節(jié)的能力；兩步離心法制備的PRP含有較高濃度的PD