富血小板血漿誘導肌腱干細胞增殖分化對肌腱微損傷修復的作用.pdf

1、肌腱病(tendinopathy)是骨科學、運動醫(yī)學和職業(yè)病醫(yī)學的常見病之一。統(tǒng)計表明，每年至少有3000萬的肌腱病病例。大量研究表明：過度牽伸載荷導致肌腱的微損傷及不成熟的修復是其發(fā)生的直接原因，但確切的發(fā)病機制尚不清楚。臨床上對肌腱病的治療主要包括物理治療、修復與重建。修復手術包括：局部病灶清除等；重建手術主要針對肌腱病修復失??；目前重建手段有：自體肌腱移植、同種異體肌腱移植，組織工程肌腱移植等。面臨的共同問題是：缺乏具有強烈修復能

2、力的細胞、缺乏促進肌腱修復的微環(huán)境。
　　 近年來，隨著細胞治療及干細胞治療研究的發(fā)展，人們開始使用細胞療法和干細胞療法來促進肌腱的恢復。常用的細胞包括成纖維細胞、胚胎干細胞(ESCs)、骨髓間充質干細胞(BMSCs)、脂肪干細胞(ADSCs)等等。2007年，Bi et al.發(fā)現(xiàn)肌腱里含有新的類型細胞-肌腱干/祖細胞(Tendon stem/progenitor cells，TSCs)。是肌腱細胞的前體細胞，這些細胞具有干細

3、胞的普遍特征；TSCs在生理狀態(tài)下可分化、增殖成肌腱細胞；TSCs在病理狀態(tài)下可分化為成骨、成脂、成軟骨細胞及成肌腱細胞；TSCs對肌腱損傷修復及保持肌腱微環(huán)境起著關鍵性的作用；TSCs的發(fā)現(xiàn)勢必為運用干細胞治療的方法治療肌腱病提供可能。
　　 肌腱是連接肌肉和骨骼的纖維結締組織，經(jīng)常要承受很強的機械壓力，從而傳遞肌肉產(chǎn)生的張力維持關節(jié)的活動和穩(wěn)定。在受力的過程中，肌腱會改變新陳代謝，并適時改變其結構及力學特性。因此，深入理解新

4、分離的TSCs對機械壓力的響應，將對我們了解肌腱在受力環(huán)境下生理學的變化非常必要。富血小板血漿(platelet-richplasma，PRP)含有大量的生長因子，如PDGF、EGF、TGF-β1、IGF等，這些因子對肌腱的修復及保持肌腱微環(huán)境具有很大的促進作用。有文獻報道，PRP的激活態(tài)(PRCR)能促進TSCs的增殖及膠原蛋白的產(chǎn)量。在體內，PRCR促進了肌腱細胞的增殖及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達，而這些是肌腱的主要組成部分。然而，T

5、SCs在受力過后，PRCR對TSCs分化的作用并未見報道。本研究將詳細研究PRP對受力后的TSCs的影響，以進一步確定PRP對肌腱修復的作用及其機制。
　　 目的：
　　 1、通過分離、鑒定大鼠肌腱干細胞(TSCs)，發(fā)現(xiàn)其具有干細胞的普遍特性，包括克隆、增殖、多向分化潛能；
　　 2、明確機械牽拉對TSCs增殖及分化的影響；
　　 3、探查富血小板血漿對TSCs增殖及分化的影響；
　　 4、分析

6、富血小板血漿復合TSCs對肌腱急性損傷的作用；
　　 5、通過富血小板血漿復合TSCs為肌腱病修復提供新的手段。
　　 方法：
　　 1.大鼠肌腱干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：8周齡SD大鼠取后肢的跟腱，分離、培養(yǎng)具有多向分化潛能的肌腱干細胞。研究其克隆形成能力及不同代數(shù)的形態(tài)學變化。采用流式細胞術測定干細胞表面抗原標志，利用免疫熒光檢測肌腱相關蛋白及軟骨相關蛋白的表達，并研究其向成骨、成脂及成軟骨細胞方向分化的能力

7、。
　　 2.機械載荷對TSCs增殖及分化的影響：我們首先研制出一套TSCs循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)，建立體外肌腱干細胞過度牽拉模型并予以測試。使用這套體外裝置，我們系統(tǒng)的研究了不同強度的機械牽拉對TSCs形態(tài)學、增殖、周期及凋亡的影響，并通過檢測成骨、成脂、成軟骨標志基因的表達來分析TSCs分化的改變。
　　 3.富血小板血漿對TSCs增殖及分化的影響：研究TSCs在受力過后，PRP對TSCs增殖、分化及相關基因表達的影響。應

8、用Western blot檢測肌腱細胞、脂肪細胞及成骨細胞標志蛋白的表達，并通過流式細胞術確定各組陽性細胞所占的比例。應用ELISA檢測TGF-β1與VEGF的表達。
　　 4.富血小板血漿復合肌腱干細胞治療急性肌腱損傷：48只經(jīng)肉毒桿菌毒素處理的大鼠作為unloaded組，另外48只作為loaded組。隨機將大鼠分為4組：A組-PBS處理，B組-PRP處理，C組-TSCs處理，D組-PRP+TSCs處理。移植后3天及14天，取

9、跟腱組織進行組織學、免疫組化及基因表達檢測。
　　 5.富血小板血漿復合肌腱干細胞治療慢性肌腱損傷：26只大鼠通過度運動建立慢性肌腱病模型。其中24只大鼠被隨機分為4組，并做相應的注射處理：對照、PRP、TSCs、PRP+TSCs。剩下的兩只通過注射綠色熒光蛋白標記的TSCs做體內細胞示蹤實驗。4周及8周后，取材并分析肌腱組織的病理組織學及基因表達情況，以評價肌腱組織的修復情況。
　　 結果：
　　 1.成功的分

10、離出大鼠肌腱干細胞TSCs。TSCs具有克隆形成能力及很高的增殖能力。經(jīng)流式細胞術分析，TSCs表達干細胞標志CD44及CD90，CD34及CD31表達均為陰性。免疫熒光結果表明，P3代TSCs表達α-SMA、tenascin C、aggrecan及ColⅠ呈陽性，而ColⅡ表達陰性。TSCs具有向成骨、成脂、成軟骨細胞分化的能力。
　　 2.TSCs在受力條件下，細胞沿微槽貼壁生長良好，細胞明顯拉長：細胞增殖能力增加，并隨著受

11、力強度的增加而大幅增加；4%機械拉伸有利于TSCs向肌腱細胞方向分化。而加載8%機械拉伸后對TSCs向多個方向的分化均有利。
　　 3.富血小板血漿明顯促進了TSCs增殖，并促進Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達。同時，成骨及成脂標志基因明顯降低，表明TSCs受力過后，PRP促進了其向肌腱細胞方向分化，并抑制向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞分化，從而降低了脂肪小滴累積、粘液性的變性及組織的鈣化。
　　 4.在受力條件下，T

12、SCs復合PRP處理對急性肌腱損傷愈合具有協(xié)同促進作用。受力促進了TSCs的增殖及分化成肌腱細胞，改善了肌腱的修復效果，Ⅰ、Ⅲ型膠原及Smad8的表達量增加。
　　 5.TSCs復合PRP改善了慢性肌腱損傷肌腱的結構，膠原含量增加。8周后注射的TSCs仍然存活，并可實現(xiàn)追蹤。免疫組化結果顯示，PRP復合TSCs移植增加了損傷肌腱處Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，而Rundx2、PPARγ、SOX9的表達受到抑制。
　　 結論：

13、>　　 1.TSCs的成功分離和鑒定有助于我們更清晰的了解其在肌腱生理、康復及發(fā)病過程中的作用，從而為運用干細胞治療的方法治療肌腱病提供可能。
　　 2.適度的壓力可能會促進TSCs自我更新或向肌腱細胞分化，而高強度的壓力是有害的，因為它誘導TSCs向非肌腱細胞分化，如脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞，或三者的混合體，在體內表現(xiàn)為脂肪積累、類粘蛋白形成或組織鈣化等肌腱病癥狀。
　　 3.富血小板血漿通過誘導TSCs向肌腱細