TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)體外肌腱干細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、肌腱病是由過度牽拉引起肌腱微損傷所致，其主要病理表現(xiàn)為肌腱組織的異位骨化和脂肪組織形成。肌腱細(xì)胞是肌腱微損傷修復(fù)的主要功能細(xì)胞，但它們是終末細(xì)胞無分化潛能;肌腱干細(xì)胞(TSCs，tendon stem cells)是肌腱細(xì)胞的唯一前體細(xì)胞,且分化能力強(qiáng)，具有多向分化潛能，TSCs對肌腱微損傷修復(fù)可能起到?jīng)Q定性作用。
　　課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，在肌腱微損傷的修復(fù)過程中，“適度”牽拉可能導(dǎo)致TSCs向成肌腱分化有利于肌腱微損傷修復(fù)，“

2、過度”牽拉可導(dǎo)致TSCs成骨、成脂分化，加重肌腱損傷導(dǎo)致修復(fù)失敗。TGF-β3作為TGF-β超家族的成員，廣泛存在于各種組織中，文獻(xiàn)報(bào)道其對于多種于細(xì)胞的分化有不同的作用且具有機(jī)械敏感性，然而它在TSCs分化中是否發(fā)揮作用以及作用的機(jī)制尚不清楚。
　　本課題分別探索機(jī)械牽拉對TSCs分化及TGF-β3表達(dá)的影響，TGF-β3對TSCs分化的影響，并最終明確TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs分化中的作用。
　　第一部分 不同

3、強(qiáng)度的機(jī)械牽拉誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞分化及TGF-β3表達(dá)的影響
　　TSCs具有多向分化潛力，且可受機(jī)械牽拉影響而分化。第一部分實(shí)驗(yàn)將通過不同強(qiáng)度機(jī)械牽拉體外培養(yǎng)的TSCs，明確導(dǎo)致TSCs“正?！焙汀爱惓！狈只牧W(xué)條件，以及機(jī)械牽拉對TGF-β3表達(dá)的影響。
　　一、實(shí)驗(yàn)方法
　　1.TSCs的分離培養(yǎng)和鑒定取3周齡雄性SD大鼠跟腱，使用酶消化法提取原代細(xì)胞。在細(xì)胞融合達(dá)到90％時(shí)進(jìn)行傳代，取P3代用于實(shí)驗(yàn)。
　　

4、2.細(xì)胞牽拉實(shí)驗(yàn)
　　P3代細(xì)胞接種于硅膠培養(yǎng)皿。使用4％、8％牽拉強(qiáng)度以及1Hz牽拉頻率牽拉TSCs，在牽拉的第12h、24h、36h、48h收集細(xì)胞用于檢測。同時(shí)接種同批次細(xì)胞于硅膠培養(yǎng)皿作為對照組。
　　3.細(xì)胞分化方向檢測
　　PCR檢測成肌腱分化標(biāo)志性基因Ⅰ型膠原(Collagen TypeI，Col I)，TNC，TNMD，Scx;成骨分化標(biāo)志性基因Runx2;成軟骨分化標(biāo)志性基因Sox9;成脂肪分化標(biāo)志性

5、基因PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平以確定細(xì)胞分化方向。并確定成肌腱和成骨的牽拉條件。
　　4.TGF-β3表達(dá)變化的檢測
　　以不牽拉組為對照組，PCR檢測TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平。
　　二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.機(jī)械牽拉對TSCs分化的影響
　　4％和1Hz條件下牽拉細(xì)胞24-36小時(shí)，成肌腱分化標(biāo)志性基因ColI，TNC，TNMD和Scx的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對照組的2.50±10.7，4.12±1.46，2.56±

6、0.07，1.41±0.34倍。成軟骨標(biāo)志性基因Sox9及成脂標(biāo)志性基因PPARγ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對照組的0.49±0.25,0.53±0.19倍。
　　8％和1Hz牽拉細(xì)胞24小時(shí)，成肌腱分化標(biāo)志性基因ColI，TNMD的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為對照組的1.84±0.53，2.22±0.45倍，之后出現(xiàn)下降。在牽拉第24-36小時(shí)，成骨標(biāo)志性基因Runx2，成軟骨標(biāo)志性基因Sox9和成脂標(biāo)志性基因PPARγ的mRNA轉(zhuǎn)錄水

7、平分別為對照組的2.42±0.43，2.78±0.85，3.33±1.17倍。牽拉12-48小時(shí)，TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平為對照組的2.53-4.71倍。
　　2.機(jī)械牽拉對TGF-β3表達(dá)量的影響
　　4％，1Hz條件下牽拉12-48小時(shí)，TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平為對照組的1.69-3.24倍;8％，1Hz條件下牽拉12-48小時(shí)，TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平為對照組的2.53-4.71倍。
　　三、小結(jié)
　　1.4％機(jī)

8、械牽拉36小時(shí)可以促進(jìn)成肌腱標(biāo)志基因的表達(dá)，并抑制成脂相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)。
　　2.8％機(jī)械牽拉24-36小時(shí)可以促進(jìn)成肌腱標(biāo)志基因的表達(dá)的同時(shí)，啟動成軟骨、成骨、成脂等異常分化。
　　3.在4％和8％體外機(jī)械牽拉均可誘導(dǎo)TSCsTGF-β3表達(dá)升高，8％較4％的牽拉強(qiáng)度，在相同時(shí)間TGF-β3升高倍數(shù)更高。
　　第二部分 不同濃度的TGF-β3對體外肌腱干細(xì)胞分化的影響
　　根據(jù)第一部分結(jié)果，對體外培養(yǎng)TSCs予以

9、TGF-β3處理，最終明確其在TSCs分化中的作用。
　　一、實(shí)驗(yàn)方法
　　取P3代TSCs接種于普通培養(yǎng)皿中，使用終濃度為1ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml的TGF-beta3處理，在處理1、3、5大后收集細(xì)胞，PCR檢測分化相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.TGF-β3濃度在2.5-5ng/ml，處理3-5天時(shí)，成肌腱分化標(biāo)志物ColI、TNC、TNMD、Scx轉(zhuǎn)錄水平分別為對照組的1

10、.49-1.85、1.57-3.03、1.53-3.65和1.65-2.29倍，隨濃度和處理時(shí)間的增加而增加。
　　2.在TGF-β3濃度為1-2.5ng/ml，處理第1天，成軟骨分化標(biāo)志物Sox9為對照組的0.34-0.73倍;TGF-β3濃度為2.5-5ng/ml，處理第5天時(shí)，成軟骨分化標(biāo)志物Sox9和ColⅡ分別為對照組的1.38-1.40和1.44倍。
　　3.在TGF-β3濃度為1-2.5ng/ml，處理第1天，

11、成骨分化標(biāo)志物Rux-2為對照組的0.54-0.56倍;TGF-β3濃度為2.5-5ng/ml，處理第5天時(shí)，成骨分化標(biāo)志物Rux-2和ALP為對照組的2.60，1.93-2.42倍。
　　4.隨TGF-β3濃度和時(shí)間變化，成脂分化標(biāo)志物PPARγ表達(dá)量分別為對照組的0.36-0.68倍，TGF-β3濃度為1-5ng/ml，處理第5天，成脂分化標(biāo)志物AP2的表達(dá)量為對照組的1.59-2.63倍。
　　三、小結(jié)
　　TG

12、F-β3單一因素隨處理濃度和時(shí)間的改變可對TSCs的分化表現(xiàn)出不同作用，與不同條件牽拉對肌腱干細(xì)胞作用的情況部分類似。TGF-β3促進(jìn)TSCs向肌腱方向分化，與TGF-β3的濃度、處理時(shí)間均呈顯著性相關(guān)，且兩者存在交互作用(P＜0.05)。TGF-β3短時(shí)間、低濃度刺激會促進(jìn)TSCs向成肌腱方向分化，并抑制TSCs的成脂、成骨及成軟骨等非肌腱方向分化，而高濃度、長時(shí)間刺激會同時(shí)導(dǎo)致TSCs向成骨、成軟骨等方向分化。TGF-β3可能是機(jī)械

13、牽拉導(dǎo)致肌腱干細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。
　　第三部分 TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)體外肌腱干細(xì)胞分化中的作用研究
　　在體外機(jī)械循環(huán)牽拉TCSs的同時(shí)，使用兩種TGF-β受體抑制劑SB431542和LY2109761處理細(xì)胞，阻斷其TGF-β信號傳導(dǎo)通路，以觀察其在機(jī)械牽拉中的作用。
　　一、實(shí)驗(yàn)方法
　　取P3代TSCs接種于硅膠培養(yǎng)皿中，分別使用終濃度為2nM的SB431542和LY2109761處理處理細(xì)胞并予以

14、4％或8％的強(qiáng)度，牽拉30小時(shí)，觀察其分化情況。
　　二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　在4％牽拉的條件，使用TGF-β受體抑制劑的情況下，成肌腱標(biāo)志基因ColI，TNC，Scx的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及TNC和Scx蛋白的表達(dá)量均較牽拉組降低。
　　在8％牽拉的條件，使用TGF-β受體抑制劑的情況下，成骨標(biāo)志基因Runx2和ALP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與牽拉組無明顯差異，Runx2蛋白表達(dá)量抑制劑組較牽拉組升高。成軟骨分化標(biāo)志性基因Sox9的

15、mRNA轉(zhuǎn)錄水平抑制劑組較牽拉組降低，但其蛋白表達(dá)量無顯著性差異。成脂分化標(biāo)志性基因AP2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)抑制劑組較牽拉組降低。
　　三、小結(jié)
　　TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成肌腱方向分化中起到重要作用，在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成骨方向分化中可能起抑制作用。TGF-β3在機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs成脂方向分化中不單獨(dú)起作用，不參與機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的TSCs向成軟骨方向分化。
　　全文總結(jié):