TGF-β1在低氧誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮向平滑肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、目的：研究低氧條件下肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)向平滑肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)在此轉(zhuǎn)分化過程中的作用。 方法：1.胰酶消化法獲取豬肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并用免疫磁珠法(以PECAM-1/CD31陽(yáng)性表達(dá)作為分選標(biāo)記)對(duì)原代肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行純化； 2.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合免疫組化檢測(cè)Ⅷ因子和CD31對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定； 3.實(shí)驗(yàn)分組： 將純化后的PAEC分成四組：(1)常氧組(N)(含21％O2

2、，5％CO2和74％N2)；(2)低氧組(H)(含1％O2，5％CO2，94％N2)；(3)常氧+TGFβ1抑制組(N+TGFβ1NeutralizingAbs)；(4)低氧+TGFβ1抑制組(H+TGFβ1NeutralizingAbs)。各組分別培養(yǎng)1、4、7天； 4.平滑肌樣細(xì)胞的鑒定：形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合免疫組化檢測(cè)平滑肌標(biāo)志性蛋白α-SM-actin，判定有無平滑肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化； 5.用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(R

3、T-PCR)檢測(cè)常氧和低氧組細(xì)胞TGFβ-1mRNA.； 6.免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)常氧和低氧組細(xì)胞TGFβ-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1.免疫磁珠純化可剔除內(nèi)皮細(xì)胞中的雜細(xì)胞，獲得高純度的內(nèi)皮細(xì)胞。純化后的內(nèi)皮細(xì)胞相差顯微鏡下觀察呈典型的鋪路石樣外觀，免疫組化檢測(cè)Ⅷ因子(FⅧ)和CD31呈陽(yáng)性表達(dá)。 2.平滑肌樣細(xì)胞的鑒定：形態(tài)學(xué)觀察轉(zhuǎn)化細(xì)胞呈梭形，免疫組化檢測(cè)α-SM-actin呈陽(yáng)性表達(dá)。

4、 3.各組細(xì)胞轉(zhuǎn)化率比較：第1天各組均未出現(xiàn)平滑肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(圖7、8)；第4天和7天N組未出現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，H組出現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且第7天H組轉(zhuǎn)化率明顯高于第4天H組轉(zhuǎn)化率(P＜0.05)；阻斷TGFβ1的作用后，第4天和第7天H+TGFβ1NeuAbs組的轉(zhuǎn)化率分別低于其對(duì)應(yīng)的H組(P＜0.05)，其余各組均未見轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 4.低氧可增加肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TGFβ1mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。 結(jié)論：1.磁珠分選