KLF4在TGF-β1誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、為了闡明KLF4在TGF-β誘導(dǎo)VSMC分化中的作用及其分子機(jī)制，本文在系統(tǒng)研究TGF-β1對(duì)VSMC增殖、分化、遷移、細(xì)胞周期等生物學(xué)行為影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討KLF4在TGF-β1促進(jìn)VSMC分化中的作用和分子機(jī)制。旨在為揭示動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，為心血管疾病的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　 1.TGF-β1誘導(dǎo)VSMC分化與上調(diào)KLF4和TβRI表達(dá)有關(guān)本部分實(shí)驗(yàn)以VSM

2、C分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)水平作為判斷VSMC表型的指標(biāo)，檢測(cè)TGF-β1對(duì)VSMC表型及相關(guān)生物學(xué)行為的影響。為了考察TβRI是否參與TGF-β1誘導(dǎo)VSMC分化的過(guò)程，一方面，觀察敲減TβRI基因表達(dá)對(duì)VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響；另一方面，觀察KLF4過(guò)表達(dá)和敲減對(duì)TβRI表達(dá)以及對(duì)VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.1TGF-β1抑制VSMC增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程MTT分析、細(xì)胞

3、計(jì)數(shù)、傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1能以濃度（0.5、1、2、4ng/ml）和時(shí)間（24、48h）依賴的方式抑制VSMC增殖和遷移，以TGF-β1濃度為2ng/ml作用于VSMC48h對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用最強(qiáng)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β1能以時(shí)間（6、12、24、48h）依賴的方式抑制VSMC細(xì)胞周期的進(jìn)程。TGF-β1（2ng/ml）刺激VSMC48h后，停滯于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)顯著增加，同時(shí)處于S

4、期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯減少。
　　 1.2TGF-β1誘導(dǎo)VSMC分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin表達(dá)SM22α和SMα-actin表達(dá)是VSMC處于分化狀態(tài)的重要分子標(biāo)志，PCNA表達(dá)是VSMC處于增殖狀態(tài)的重要標(biāo)志。
　　 1.3敲減TβRI表達(dá)對(duì)VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響
　　 1.4KLF4在TGF-β1誘導(dǎo)TβRI表達(dá)及VSMC分化中的作用雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KLF4是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分

5、化和凋亡的調(diào)控，但KLF4是否通過(guò)TβRI介導(dǎo)TGF-β1的作用目前尚不清楚。
　　 2.TGF-β1通過(guò)激活Smad和p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)KLF4磷酸化和KLF4與Smad2/3相互作用TGF-β1通過(guò)與VSMC上的相應(yīng)受體相互作用而觸發(fā)細(xì)胞信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而活化Smad信號(hào)通路而激活相關(guān)基因表達(dá)。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是胞內(nèi)信號(hào)進(jìn)行交互作用

6、的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在上述闡明KLF4通過(guò)TβRI介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)VSMC分化的基礎(chǔ)上，本部分實(shí)驗(yàn)探討TGF-β1對(duì)Smad和MAPK信號(hào)途徑的影響，以期闡明TGF-β1誘導(dǎo)KLF4活化和促進(jìn)細(xì)胞分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 2.1TGF-β1通過(guò)激活Smad和p38MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)KLF4磷酸化VSMC經(jīng)TGF-β1（2ng/ml）刺激5、10、20、40min，用磷酸化絲氨酸抗體對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀后檢測(cè)磷酸化KLF

7、4的水平。
　　 2.2TGF-β1通過(guò)誘導(dǎo)KLF4磷酸化而促進(jìn)KLF4與Smad2/3相互作用免疫共沉淀分析結(jié)果顯示，VSMC被TGF-β1處理后，KLF4與Smad2/3相互作用形成的復(fù)合物明顯增加。VSMC在TGF-β1（2ng/ml）刺激5、10、20、40min后，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，KLF4與Smad2/3的結(jié)合明顯增加，交互免疫沉淀也得到相似的結(jié)果。表明，TGF-β1能顯著促進(jìn)KLF4與Smad2/3的相互作用，并

8、具有明顯的時(shí)效關(guān)系。
　　 2.3KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI基因表達(dá)上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β1促進(jìn)KLF4與Smad2/3相互作用。為了檢查KLF4與Smad2/3相互作用在調(diào)節(jié)TβRI表達(dá)中的意義，我們首先進(jìn)行了報(bào)告基因分析。將TβRI啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因分別與KLF4或Smad2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞時(shí)，KLF4和Smad2均能促進(jìn)TβRI啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。KLF4和Smad2共轉(zhuǎn)染使TβRI啟動(dòng)子活性比轉(zhuǎn)染其

9、中一種表達(dá)質(zhì)粒升高1倍左右。表明KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI基因表達(dá)。
　　 3.KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI啟動(dòng)子的作用機(jī)制對(duì)TβRI基因啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析的結(jié)果表明，TβRI啟動(dòng)子區(qū)存在KLF4（CACCC）和Smad（CAGAC）結(jié)合位點(diǎn)。本部分實(shí)驗(yàn)研究KLF4和Smad2與其結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，進(jìn)一步揭示KLF4和Smad2對(duì)TβRI基因表達(dá)的調(diào)控方式。
　　 3.1KLF4直接

10、結(jié)合于TβRI啟動(dòng)子區(qū)的CACCC元件上并激活TβRI基因轉(zhuǎn)錄TβRI啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，KLF4以劑量依賴的方式增強(qiáng)TβRI啟動(dòng)子的活性。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（CHIP）結(jié)果顯示，內(nèi)源性和外源性的KLF4均可結(jié)合到TβRI啟動(dòng)子上。缺失TβRI啟動(dòng)子區(qū)的KLF4結(jié)合位點(diǎn)及突變KLF4結(jié)合位點(diǎn)后進(jìn)行報(bào)告基因分析的結(jié)果表明，KLF4通過(guò)與TβRI啟動(dòng)子近端的兩個(gè)KLF4結(jié)合位點(diǎn)：即KLF4結(jié)合位點(diǎn)2（-402～-398，CAC

11、CC）和位點(diǎn)3（-343～-339，CACCC）相互作用而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。Oligopull-down分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，KLF4直接結(jié)合于TβRI啟動(dòng)子區(qū)的KLF4結(jié)合位點(diǎn)2和3上。
　　 3.2Smad2在TGF-β1誘導(dǎo)TβRI表達(dá)中的作用Smad是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員。上述研究結(jié)果表明，KLF4可直接激活TβRI基因的表達(dá)，但與KLF4相互作用的Smad2和Smad3是否影響TβRI基因的表達(dá)，目前尚不

12、清楚。
　　 本部分實(shí)驗(yàn)將靶向Smad2或Smad3的siRNA導(dǎo)入VSMC，阻斷內(nèi)源性Smad2或Smad3的表達(dá)后，檢查Smad2或Smad3在TGF-β1誘導(dǎo)TβRI表達(dá)中的作用。Westernblot分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Smad2或Smad3的siRNA在敲低Smad2或Smad3表達(dá)的同時(shí)，也顯著降低TβRI基因的表達(dá)。以Smad2表達(dá)載體pcDNA3.0-Smad2轉(zhuǎn)染VSMC，證實(shí)Smad2在VSMC中的過(guò)表達(dá)能顯著

13、上調(diào)TβRI的表達(dá)。這些結(jié)果提示，Smad2和Smad3與TβRI的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 3.3Smad2通過(guò)與TβRI啟動(dòng)子區(qū)的Smad結(jié)合元件相互作用而激活基因表達(dá)TβRI啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因分析結(jié)果表明，Smad2也能以劑量依賴性方式增強(qiáng)TβRI啟動(dòng)子的活性。ChIP分析結(jié)果顯示，在用Smad2抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中可以擴(kuò)增得到TβRI基因啟動(dòng)子區(qū)的Smad（-806～-561）結(jié)合區(qū)域，TGF-β1處理使Smad

14、2與DNA的結(jié)合顯著增加。
　　 為了定位TβRI啟動(dòng)子區(qū)的Smad2結(jié)合元件，進(jìn)一步對(duì)截短的TβRI啟動(dòng)子進(jìn)行報(bào)告基因分析。結(jié)果表明，Smad2只能激活含TβRI轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-993bp的TβRI啟動(dòng)子，不能激活截短的、缺失-806～-561核苷酸序列的TβRI啟動(dòng)子。結(jié)果提示，Smad結(jié)合元件位于TβRI啟動(dòng)子區(qū)的-806～-561區(qū)域。
　　 3.4KLF4與預(yù)先結(jié)合在Smad結(jié)合位點(diǎn)上的Smad2協(xié)同激活TβR

15、I基因轉(zhuǎn)錄交互ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在用KLF4抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中既能擴(kuò)增得到TβRI基因啟動(dòng)子區(qū)的KLF4結(jié)合序列（-483～-241），又能擴(kuò)增得到Smad結(jié)合序列（-806～-561），而在Smad2抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中，只能擴(kuò)增到TβRI基因啟動(dòng)子區(qū)的Smad結(jié)合序列，不能擴(kuò)增得到KLF4的結(jié)合序列。這些結(jié)果表明，KLF4-Smad2復(fù)合物位于Smad結(jié)合區(qū)。連續(xù)ChIP分析進(jìn)一步顯示，在用Smad2抗體再

16、次沉淀KLF4抗體沉淀得到的染色質(zhì)片段時(shí)，二次沉淀物中仍能擴(kuò)增得到Smad結(jié)合序列。以上結(jié)果再次表明，KLF4與Smad2在TβRI基因啟動(dòng)子的Smad結(jié)合區(qū)形成復(fù)合物。
　　 為了進(jìn)一步證實(shí)在Smad結(jié)合區(qū)形成的KLF4-Smad2復(fù)合物能協(xié)同激活TβRI基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)缺失KLF4或Smad2結(jié)合位點(diǎn)的TβRI啟動(dòng)子進(jìn)行報(bào)告基因分析。結(jié)果表明，缺失Smad結(jié)合區(qū)域（-806～-561）后，Smad2的轉(zhuǎn)錄激活作用以及Smad2

17、和KLF4的協(xié)同激活作用消失。用Smad2-siRNA靶向敲低Smad2表達(dá)后進(jìn)行報(bào)告基因分析的結(jié)果表明，敲低Smad2的表達(dá)也消弱了KLF4的轉(zhuǎn)錄激活作用，說(shuō)明KLF4的激活作用部分依賴于與Smad結(jié)合區(qū)結(jié)合的Smad2。以上結(jié)果表明，KLF4與Smad2在Smad結(jié)合區(qū)形成復(fù)合物協(xié)同激活TβRI基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 結(jié)論
　　 1.TGF-β1通過(guò)KLF4介導(dǎo)的TβRI表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞周期的進(jìn)程并促進(jìn)分化。

18、>　　 2.TGF-β1通過(guò)激活Smad和p38MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)KLF4的磷酸化，磷酸化型KLF4與Smad2/3的相互作用增強(qiáng)。
　　 3.KLF4直接結(jié)合于TβRI啟動(dòng)子區(qū)KLF4結(jié)合位點(diǎn)2（-402～-398，CACCC）和結(jié)合位點(diǎn)3（-343～-339，CACCC）并轉(zhuǎn)錄激活TβRI基因的表達(dá)，Smad2通過(guò)與Smad結(jié)合元件相互作用激活TβRI基因的表達(dá)。
　　 4.KLF4與預(yù)先結(jié)合在Smad結(jié)合元件上