ROCK通過miRNA--92a作用KLF4促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種嚴(yán)重危害人類生命和健康常見疾病，目前已成為發(fā)達(dá)國(guó)家人口死亡的主要原因之一。AS是由于各種刺激因素作用于動(dòng)脈血管壁引起的炎癥性疾病，是心腦血管病的主要誘因。然而AS在體內(nèi)的具體發(fā)生過程及原因還沒有清楚地解釋，因此探討其具體發(fā)病機(jī)制對(duì)心血管疾病的防治和人類的身體健康有重大意義。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程與血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells，

2、VSMCs)功能的改變密切相關(guān)。VSMCs可以通過調(diào)節(jié)介質(zhì)如血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)刺激從血管壁的中向內(nèi)膜遷移，這一改變是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要步驟之一。Rho激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶家族，在VSMCs的遷移和增殖過程中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制主要是

3、通過調(diào)控微絲骨架組裝和細(xì)胞的局部連接。然而，ROCK對(duì)AS發(fā)生過程中血管重構(gòu)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確。以往研究已經(jīng)證實(shí)，微小RNA（miRNA）與AS的發(fā)生有密不可分的聯(lián)系。本研究擬通過培養(yǎng)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells，AoSMCs)，大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(A7r5)和大鼠原代胸主動(dòng)脈細(xì)胞來探索miRNAs對(duì)ROCK調(diào)控的血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移的影響及機(jī)制。
　　方法:(

4、1)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qPCR)檢測(cè)利用ROCK的抑制劑Y27632處理A7r5后miRNA-92a的變化;(2)利用siRNA干擾技術(shù)，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ROCK siRNA(siROCK)，運(yùn)用qPCR檢測(cè)ROCK mRNA水平基因表達(dá)是否成功下調(diào);(3)使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染miR-92a模擬物(Pre-miR-92a)和抑制劑(An

5、ti-miR-92a)，在VSMCs中抑制或過表達(dá)，運(yùn)用qPCR檢測(cè)miR-92a是否成功上調(diào)或下調(diào);(4)利用siRNA干擾技術(shù)，對(duì)miR-92a進(jìn)行上調(diào)和下調(diào)后qPCR檢測(cè)ROCK mRNA的表達(dá)水平變化;(5)分別采用Boyden Chamber和CCK-8檢測(cè)miR-92a和ROCK對(duì)VSMCs遷移和增殖的影響;(6)利用CCK-8及Boyden Chamber方法檢測(cè)miR-92a靶基因哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子4(Krüppel-li

6、ke factor4，KLF4)對(duì)VSMCs增殖和遷移的影響;(7)運(yùn)用Western blot檢測(cè)ROCK的抑制劑Y27632處理VSMCs后KLF4的表達(dá)情況;(8)運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分析miR-92a和ROCK對(duì)VSMCs細(xì)胞偽足伸出情況和KLF4表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)ROCK抑制劑Y27632使miR-92a的表達(dá)下調(diào);(2)miR-92a的模擬物和抑制劑對(duì)ROCK的表達(dá)量無明顯影響;(3)Anti-miR-92a

7、可抑制由PDGF誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞的增殖和遷移，而Pre-miR-92a可以促進(jìn)A7r5細(xì)胞的增殖與遷移;(4)ROCK抑制劑Y27632可以抑制由PDGF誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞的增殖和遷移;(5)Pre-miR-92a可以恢復(fù)Y27632對(duì)VSMCs增殖和遷移的抑制作用;(6)KLF4可以抑制VSMCs的增殖和遷移;(7)Y27632使A7r5細(xì)胞中KLF4表達(dá)量增加;(8)在PDGF-BB刺激下，anti-miR-92a使KLF4表達(dá)量