外源性TGF-β-,1-及IGF-1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)已成為近年來骨科臨床基礎(chǔ)研究的一個重要課題，關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)包括關(guān)節(jié)軟骨、軟骨細(xì)胞、骨膜和軟骨膜的移植，軟骨下骨鉆孔或磨造，凝膠或纖維的植入，藥物修復(fù)法，基因治療及組織工程軟骨等。在軟骨組織工程研究中，種子細(xì)胞始終是一個至關(guān)重要的問題。最近的研究提示，在脂肪組織中也存在一種多能基質(zhì)干細(xì)胞，具備向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，其取材容易，損傷較小，生物學(xué)性狀穩(wěn)定，可長期增殖，這種細(xì)胞有可能

2、替代MSCs，成為新的組織工程的種子細(xì)胞來源。ADSCs同MSCs一樣具有多向分化潛能，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可向軟骨、骨、肌肉和脂肪細(xì)胞等方向轉(zhuǎn)化。Indrawattana等報道，利用TGF-β1和IGF-1協(xié)同誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，軟骨基質(zhì)分泌及特征性基因表達(dá)水平均優(yōu)于單一生長因子誘導(dǎo)，認(rèn)為聯(lián)合應(yīng)用這兩種生長因子不單純是單一作用的疊加，而是發(fā)揮協(xié)同放大效應(yīng)。目前國內(nèi)外未見TGF-β1和IGF-1協(xié)同誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化的相

3、關(guān)報道，但鑒于ADSCs和MSCs基因表達(dá)的高度相似性，我們有理由相信，TGF-β1和IGF-1同樣能夠協(xié)同促進(jìn)ADSCs向軟骨細(xì)胞定向分化。 試驗?zāi)康模?探討大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增方法及單層培養(yǎng)條件下外源性轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1和胰島素樣生長因子IGF-1誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞定向分化的可能性及兩者的協(xié)同作用分析，為應(yīng)用新型種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨提供新思路。 試驗方法： 取

4、大鼠大網(wǎng)膜及腎周脂肪囊等處脂肪組織，充分剪碎后加入0.1％Ⅰ型膠原酶，酶消化法及密度梯度離心法相結(jié)合，分離、純化SD大鼠ADSCs，倒置相差顯微鏡觀察各代ADSCs的形態(tài)學(xué)改變。取第3代生長良好的脂肪干細(xì)胞，免疫熒光法檢測其表面抗原CD29、CD44表達(dá)；取第3代生長良好的脂肪干細(xì)胞，分別用四組誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向軟骨方向誘導(dǎo)，同時設(shè)定未誘導(dǎo)組為空白組；誘導(dǎo)2周后細(xì)胞爬片，免疫熒光法檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)；RT-PCR、Western

5、blot對定向誘導(dǎo)后的細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行檢測。 結(jié)果： 1、原代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞24小時即可見細(xì)胞貼壁，5d后細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長，形成集落。約7d左右細(xì)胞融合超過90％時即可傳代，傳代后細(xì)胞生長速度明顯加快，形態(tài)較均一，呈長梭形，排列緊密，類似成纖維細(xì)胞。 2、免疫熒光法檢測細(xì)胞表面抗原CD29和CD44，結(jié)果顯示表面抗原CD29和CD44.呈陽性表達(dá)，證實為干細(xì)胞來源。 3、向軟骨方向定向誘導(dǎo)后，各組細(xì)胞生長

6、速度均變慢，以對照組為明顯；除對照組外，各組細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)槎噙呅危嘟切?，可見?xì)長偽足，核周出現(xiàn)黑色顆粒，隨誘導(dǎo)時間延長，細(xì)胞開始變圓，核偏位，核周顆粒明顯，細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)，形成軟骨樣結(jié)節(jié)，TGF-β1組及TGF-β1+IGF-1組較為明顯。 4、免疫熒光鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞Collaggen Ⅱ表達(dá)結(jié)果顯示IGF-1組、TGF-β1組及TGF-β1+IGF-1組分別呈弱陽性、陽性及強(qiáng)陽性，對照組偶可見單個細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，空白組

7、呈陰性反應(yīng)。 5、RT-PcR檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞Collagen Ⅱ、Aggrecan mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，除空白組外其余四組細(xì)胞表達(dá)CollagenⅡ mRNA，且表達(dá)量依次增加，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析此四組與空白組間及其各自組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；IGF-1組、TGF-β1組及TGF-β1+IGF-1組三組細(xì)胞表達(dá)Aggrecan mRNA，且表達(dá)量依次增加，但空白組及對照組則未見表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析空白組及對照組間差別無統(tǒng)

8、計學(xué)意義(P>0.05)，其余三組與此兩組間及其各自組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)6、Western blot檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，除空白組外其余四組細(xì)胞表達(dá)Collagen Ⅱ蛋白，且表達(dá)量依次增加，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析此四組與空白組間及其各自組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論： 1、從大鼠脂肪組織中可分離出脂肪干細(xì)胞，細(xì)胞在體外增生活躍，生物學(xué)性狀穩(wěn)定。 2、脂肪干細(xì)胞表