嚴(yán)重?zé)齻蟠笫蠊撬琛熬藓思?xì)胞被噬現(xiàn)象”機(jī)制的實驗研究.pdf

1、本室前期研究發(fā)現(xiàn)，單純放射損傷、嚴(yán)重?zé)齻蜔龥_復(fù)合傷的大鼠、犬骨髓巨核細(xì)胞退變，中性粒細(xì)胞進(jìn)入巨核細(xì)胞胞漿內(nèi)將其噬食，命名為“巨核細(xì)胞被噬現(xiàn)象”(megakaryocytophagia)，并認(rèn)為這是嚴(yán)重創(chuàng)傷時血小板數(shù)量減少、功能降低的主要原因之一。血小板數(shù)量和功能的降低是引發(fā)機(jī)體出血、感染、多器官功能衰竭的重要因素，是嚴(yán)重創(chuàng)傷救治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但巨核細(xì)胞被噬現(xiàn)象的發(fā)生是中性粒細(xì)胞發(fā)揮清除機(jī)體退變細(xì)胞的功能，還是巨核細(xì)胞受損后發(fā)出某種信號吸

2、引中性粒細(xì)胞前往，何種細(xì)胞占主導(dǎo)地位，未見有文獻(xiàn)報道。 關(guān)于巨核細(xì)胞體內(nèi)有粒細(xì)胞或其他血細(xì)胞的現(xiàn)象早有文獻(xiàn)報道，但對其性質(zhì)、發(fā)生機(jī)理和意義有不同的看法。有觀點(diǎn)認(rèn)為巨核細(xì)胞體內(nèi)的其它細(xì)胞與巨核細(xì)胞是共生的，兩者獨(dú)立存在、沒有任何關(guān)系；有人認(rèn)為巨核細(xì)胞體內(nèi)的紅細(xì)胞是兩者的重疊；還有人認(rèn)為巨核細(xì)胞有游移的能力，能主動將其它細(xì)胞包繞入體內(nèi)等等。近年來，巨核細(xì)胞體內(nèi)存在其它血細(xì)胞的現(xiàn)象更加引起學(xué)者們的關(guān)注。在血小板減少性紫癜的動物模型、特

3、發(fā)性骨髓纖維化病人的骨髓活檢及骨髓纖維化動物模型、轉(zhuǎn)染血小板生成素(TPO)的小鼠、核轉(zhuǎn)錄因子GATA-1低表達(dá)的小鼠等情況均發(fā)生不同程度的進(jìn)入巨核細(xì)胞的中性粒細(xì)胞數(shù)量增加；同時伴有外周血血小板數(shù)量減少的現(xiàn)象。巨核細(xì)胞是血小板生成的前體細(xì)胞，巨核細(xì)胞的病理改變及其機(jī)能狀態(tài)直接影響到血小板的產(chǎn)生與補(bǔ)充；因此，研究巨核細(xì)胞在疾病和損傷情況的改變具有十分重要的意義。 本實驗首先以30％Ⅲ度燒傷大鼠為動物模型，較為系統(tǒng)地觀察了嚴(yán)重?zé)齻?/p>

4、骨髓“巨核細(xì)胞被噬現(xiàn)象”；利用在體實驗觀察了嚴(yán)重?zé)齻笳{(diào)控巨核細(xì)胞增殖、分化和不同成熟階段生長因子的表達(dá)變化；同時利用體外Transwell穿膜等實驗觀察了正常和嚴(yán)重?zé)齻蟠笫蠊撬杈藓思?xì)胞與中性粒細(xì)胞的遷移、游走情況，重點(diǎn)觀察巨核細(xì)胞特異性分泌、對中性粒細(xì)胞又有特異性趨化作用的細(xì)胞因子-中性粒細(xì)胞激活肽2(NAP-2)的變化；旨在闡明嚴(yán)重創(chuàng)傷后“骨髓巨核被噬現(xiàn)象”可能發(fā)生的機(jī)制。主要的方法和結(jié)果如下： (一)骨髓組織切片觀察：正

5、常大鼠骨髓中有大量有核細(xì)胞，可見處于不同成熟期的巨核細(xì)胞，很少見巨核細(xì)胞被噬食；30％Ⅲ度燒傷后24h骨髓腔充血明顯，巨核細(xì)胞退變，部分巨核細(xì)胞胞漿溶解；退變的巨核細(xì)胞被中性粒細(xì)胞包繞、食噬，呈“蟲蝕樣”改變。采用NAP-2和CD-15分別標(biāo)記巨核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，可見深紫色的中性粒細(xì)胞在紅色的巨核細(xì)胞體內(nèi)。 (二)燒傷后調(diào)控巨核細(xì)胞增殖、分化和成熟的細(xì)胞因子表達(dá)變化PF-4和NAP-2是巨核細(xì)胞分泌的特異性蛋白。正常組PF-4

6、主要分布在較為幼稚的巨核細(xì)胞胞漿，成熟巨核細(xì)胞表達(dá)量較低；燒傷后24hPF-4在巨核細(xì)胞的表達(dá)明顯減弱；燒傷后15d:PF-4在巨核細(xì)胞的胞漿表達(dá)增加，明顯高于燒傷后24h組，但仍低于正常組。NAP-2在正常巨核細(xì)胞胞漿、胞膜表達(dá)均為陽性；燒傷24hNAP-2表達(dá)明顯減弱；燒傷后15d表達(dá)增加，強(qiáng)于燒傷后24h組，但弱于正常組的表達(dá)。TPO和IL-3是巨核細(xì)胞增殖和分化的正調(diào)節(jié)因子，TGF-β1和P-seletin是其負(fù)調(diào)控因子。TPO

7、主要分布在較為正常成熟的巨核細(xì)胞胞漿和胞膜；燒傷后24hTPO在巨核細(xì)胞的表達(dá)降低；燒傷后15dTPO表達(dá)仍低于正常組和燒傷后24h組。燒傷后24hIL-3在骨髓細(xì)胞的表達(dá)與正常對照組相比降低，15d時仍較低。正常巨核細(xì)胞胞漿和胞膜均表達(dá)TGF-β1；燒傷后24h在巨核細(xì)胞的表達(dá)略有下降，無統(tǒng)計學(xué)差異；燒傷后15d表達(dá)減弱，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。P-seletin在正常巨核細(xì)胞胞漿和胞膜均表達(dá)；燒傷后24h表達(dá)下降；燒傷后15d表達(dá)

8、弱于正常組和24h組。GATA-1和NF-E2分別參與了巨核細(xì)胞早期增殖和晚期分化成熟。GATA-1在正常骨髓幼稚和成熟巨核細(xì)胞的胞漿和胞核表達(dá)；燒傷后24hGATA-1在較幼稚的巨核細(xì)胞表達(dá)明顯減弱，而在體積較大形態(tài)易于辨認(rèn)的成熟巨核細(xì)胞表達(dá)陽性，主要分布在胞漿和胞核；燒傷后15dGATA-1在幼稚和成熟巨核細(xì)胞的表達(dá)均減弱。與正常對照組相比，燒傷后24hNF-E2表達(dá)減弱，燒傷后15d表達(dá)仍弱于前兩者。 (三)燒傷后巨核細(xì)胞

9、超微結(jié)構(gòu)的改變掃描電鏡觀察：正常大鼠骨髓巨核細(xì)胞呈圓形，表面光滑，燒傷后24h巨核細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，表面不平整，呈現(xiàn)出“珊瑚樣”改變。透射電鏡觀察：正常大鼠骨髓巨核細(xì)胞胞漿有豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和成熟顆粒，胞核呈分葉，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀彌散分布，燒傷后24h巨核細(xì)胞胞漿細(xì)胞器減少，有局灶樣壞死，并可見中性粒細(xì)胞伸出“偽足”進(jìn)入到巨核細(xì)胞的胞漿中，核皺縮，染色質(zhì)濃縮邊集。 (四)燒傷后中性粒細(xì)胞的形態(tài)和功能的變化掃描電鏡觀察中性粒細(xì)

10、胞表面形態(tài)改變：正常大鼠中性粒細(xì)胞表面較光滑，呈圓形或橢圓形，燒傷后24h的中性粒細(xì)胞表面呈不規(guī)則狀，有偽足樣突起形成。墨汁吞噬實驗顯示燒傷后24h的中性粒細(xì)胞吞噬比率(64.35％)明顯高于正常對照組(15.17％)。 (五)Transwell雙室培養(yǎng)系統(tǒng)體外觀察中性粒細(xì)胞向巨核細(xì)胞的趨化游走現(xiàn)象分離正常組和燒傷后24h大鼠骨髓巨核細(xì)胞和外周血中性粒細(xì)胞，在Transwell雙室內(nèi)進(jìn)行交叉培養(yǎng)(上室為中性粒細(xì)胞，下室為巨核細(xì)胞

11、，微孔濾膜孔徑為5岬)。分為：正常中性粒細(xì)胞+正常巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組；燒傷中性粒細(xì)胞+燒傷巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組；正常中性粒細(xì)胞+燒傷巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組；燒傷中性粒細(xì)胞+正常巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組；上室中性粒細(xì)胞下室僅有IMDM培養(yǎng)基為陰性對照組。37℃孵育2-6h后，固定、HE染色、計數(shù)穿過微孔到達(dá)膜底面的中性粒細(xì)胞數(shù)，每例10個視野，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/視野表示。結(jié)果顯示：陰性對照組未見有中性粒細(xì)胞穿過：燒傷中性粒細(xì)胞+燒傷巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組則有大量中性粒

12、細(xì)胞穿過；與各組均有顯著性差異(P＜0.01)。同時可見，正常中性粒細(xì)胞+燒傷巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組也有大量中性粒細(xì)胞穿過，與正常中性粒細(xì)胞+正常巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組、燒傷中性粒細(xì)胞+正常巨核細(xì)胞共培養(yǎng)組，以及陰性對照組相比，也有顯著性差異(P＜0.01)。體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞表達(dá)中性粒細(xì)胞趨化因子NAP-2較正常組的減弱。上室內(nèi)加入NAP-2抗體，對中性粒細(xì)胞穿膜無明顯的影響；而上室內(nèi)加入Ca2+通道抑制劑異搏定后可以明顯抑制中性細(xì)胞穿膜。

13、 結(jié)論：30％Ⅲ度燒傷后大鼠骨髓腔內(nèi)充血明顯，巨核細(xì)胞退變并被中性粒細(xì)胞包繞噬食，發(fā)生骨髓“巨核細(xì)胞被噬現(xiàn)象”。燒傷對巨核細(xì)胞的影響廣泛而嚴(yán)重，可以導(dǎo)致巨核細(xì)胞分泌的特異性蛋白NAP-2、PF-4的表達(dá)降低；正性調(diào)控因子TPO、IL-3表達(dá)減弱，而負(fù)調(diào)節(jié)因子TGF-β1，P-seletin也減少，調(diào)控巨核細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、NF-E2表達(dá)也降低。提示燒傷因素可以影響調(diào)控巨核細(xì)胞增殖分化各階段細(xì)胞因子的表達(dá)。燒傷還可以導(dǎo)致巨核

14、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形態(tài)不規(guī)則，呈珊瑚樣改變，有利于中性粒細(xì)胞進(jìn)入。體外Transwell雙室培養(yǎng)提示燒傷后的巨核細(xì)胞可以明顯趨化中性粒細(xì)胞穿膜，中性粒細(xì)胞處于功能活躍狀態(tài)；體外阻斷實驗提示中性粒細(xì)胞向巨核細(xì)胞趨化游走，與巨核細(xì)胞分泌的中性粒細(xì)胞趨化因子NAP-2表達(dá)無明顯關(guān)系，而與Ca2+通道相關(guān)。因此，我們提出燒傷后“巨核細(xì)胞被噬現(xiàn)象”的發(fā)生與巨核細(xì)胞發(fā)生退變和中性粒細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)都相關(guān)，是機(jī)體損傷后的一種轉(zhuǎn)歸機(jī)制，也說明中性