腦死亡大鼠肝臟損傷機制中自噬現(xiàn)象的實驗研究.pdf

1、目的：
　　以緩慢持續(xù)顱內(nèi)加壓法構建大鼠腦死亡模型，并在此基礎上動態(tài)觀察大鼠肝組織細胞自噬相關蛋白的表達情況，以初步明確腦死亡肝損傷機制中自噬發(fā)生的時序性，并探討細胞自噬死亡模式在肝損傷中的生物學意義。
　　方法：
　　選取SPF級SD大鼠80只，隨機分為8組各10只，隨機選取4組設為對照組（僅對各組大鼠進行麻醉處理），并按麻醉時間分為0小時組、2小時組、4小時組、6小時組；其余4組設為腦死亡組，按照腦死亡標準判定腦死

2、亡后，將以上4組大鼠按照腦死亡狀態(tài)維持在0小時、2小時、4小時、6小時。通過SD大鼠顱骨鉆孔，將Fogarty3F球囊取栓導管置入SD大鼠硬腦膜外，導管尖端指向大鼠尾側，球囊導管連接微量泵并緩慢注入生理鹽水，進行顱內(nèi)加壓，直至大鼠達到腦死亡狀態(tài)；分別采集對照組、腦死亡組SD大鼠靜脈血并檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST），分析其變化

3、；獲取對照組、腦死亡組SD大鼠新鮮肝臟組織，進行HE染色，觀察肝組織形態(tài)學的變化；并進一步采用免疫組織化學染色方法動態(tài)觀測自噬相關蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達情況，并進行半定量測定，初步明確各時點組自噬與凋亡相關蛋白表達水平變化情況。
　　結果：
　　以緩慢持續(xù)顱內(nèi)加壓法建立SD大鼠腦死亡模型，在腦死亡組中0小時組、2小時組、4小時組、6小時大鼠A

4、LT指標分別為：29.1±2.82、42.8±10.42、49.1±8.26、67.8±5.06；AST指標分別為70.0±6.08、78.4±6.41、81.9±6.96、110.6±4.73，大鼠肝功能（ALT、AST）隨腦死亡狀態(tài)的時間增長呈升高趨勢；在大體觀發(fā)現(xiàn)，隨腦死亡時間增加，肝顏色偏暗紅色，無明顯壞死灶，質(zhì)地無顯著變化，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：0小時組顯示肝匯管區(qū)有少量炎癥細胞，肝血竇內(nèi)有少量庫否細胞，肝細胞核清晰，未見壞死，胞漿

5、染色一致，無水腫；2小時組顯示肝中央靜脈及肝血竇內(nèi)淤血，庫否細胞增生不明顯，近中央靜脈肝細胞淡染，核呈泡狀，胞漿內(nèi)有大小不等的空泡，肝血竇內(nèi)出現(xiàn)少量中性粒細胞；4小時組顯示肝中央靜脈及肝血竇內(nèi)淤血，庫否細胞增生，近中央靜脈肝細胞淡染，核呈泡狀，有較多雙核肝細胞，個別肝細胞壞死，胞漿內(nèi)有大小不等的空泡，肝血竇內(nèi)出現(xiàn)少量中性粒細胞；6小時組顯示肝中央靜脈及肝血竇內(nèi)淤血，庫否細胞增生明顯，部分肝細胞淡染，核呈泡狀，有較多雙核肝細胞，可見少量肝

6、細胞壞死但未形成灶性壞死，胞漿內(nèi)有大小不等的空泡，肝血竇內(nèi)出現(xiàn)較多中性粒細胞。此外，第4、6小時組中，肝組織出現(xiàn)巨噬細胞陽性染色細胞。進一步做自噬與凋亡相關蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白在2小時時點出現(xiàn)明顯增高，一直持續(xù)到6小時時點，而凋亡抑制蛋白Bcl-2則在4小時時點開始升高并持續(xù)高水平，相應時點兩種蛋白表達水平均顯著高于0時點。
　　結論：
　?。?）以顱內(nèi)緩慢持續(xù)加壓法可建成SD大鼠腦死亡模型，可控性與成模率較高，并可導致肝