C5a對(duì)組織因子表達(dá)的影響及潛在的機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥一直是醫(yī)學(xué)界的一大挑戰(zhàn)。盡管給予患者強(qiáng)有力的抗生素治療和器官功能支持,其仍舊是ICU患者死亡的主要因?yàn)橹?。?jù)北美相關(guān)統(tǒng)計(jì):膿毒癥的發(fā)病率約為0.3％、在美國(guó)每年750,000膿毒癥患者中約有215,000死亡；ICU病房中出現(xiàn)膿毒癥的約占2％-11％、膿毒癥和膿毒癥休克的病死率分別為30％和60％。在過(guò)去的數(shù)十年,膿毒癥的病死率并沒(méi)有明顯的改善。
　　 膿毒癥共同的病理生理特征是一系列炎癥細(xì)胞被相繼激活,呈“瀑布效應(yīng)”釋

2、放出大量炎癥因子,對(duì)全身組織器官造成損傷,最終引起多器官功能障礙綜合征(multiple organs dysfunction syndromes,MODS),進(jìn)一步發(fā)展為多器官功能衰竭(multiple organs failure,MOF)。在炎癥反應(yīng)的過(guò)程中,多種生物學(xué)活性系統(tǒng)被激活如:補(bǔ)體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及凋亡相關(guān)系統(tǒng)等。其中,彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulatio

3、n,DIC)是膿毒癥患者凝血系統(tǒng)異常引發(fā)的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,一旦出現(xiàn)DIC,患者將因?yàn)槿砦⒀軓V泛微血栓的形成,造成組織器官缺血、缺氧從而加速M(fèi)ODS的進(jìn)程。一項(xiàng)研究顯示,在膿毒癥特別是膿毒癥休克的病例中,發(fā)生DIC的比例約為30～50％。凝血功能異常也儼然成為了膿毒癥病理生理過(guò)程中的突出表現(xiàn)。在膿毒癥或全身炎癥反應(yīng)過(guò)程中,多種促炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),如LPS、TNF-α、ILs、PAF、C5a等,均可引起凝血功能異常。其中,補(bǔ)體系統(tǒng)

4、活化產(chǎn)物C5a在凝血中的作用日益受到學(xué)者的關(guān)注。
　　 C5a是三條補(bǔ)體途徑共同裂解產(chǎn)生的活性產(chǎn)物,具有廣泛的生物學(xué)功能。在膿毒癥治療新策略中,拮抗C5a已經(jīng)被人們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中所提及和證實(shí),本課題組前期自主篩選合成了一種新型C5a拮抗多肽(C5a反義肽),相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了其能拮抗C5a的生物學(xué)活性,對(duì)改善小鼠膿毒癥模型的炎癥反應(yīng)有一定的保護(hù)作用。但C5a作為一種促炎介質(zhì),其在凝血方面的作用也不容忽視。已有的研究顯示,其對(duì)凝血的影響

5、包括增加炎癥細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等細(xì)胞膜表面組織因子(tissue factor,TF)的表達(dá),從而使凝血激活亢進(jìn)；降低AT-Ⅲ、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TM)等物質(zhì)的表達(dá)而使機(jī)體抗凝功能削弱；影響纖溶酶原激活物和抑制物(plasminogen activator,PA；plasminogenactivator inhibitor,PAI)的表達(dá)而使纖溶和抗纖溶平衡失調(diào)。鑒于TF是外源性凝血途徑的啟動(dòng)因子

6、,在外源性凝血激活“網(wǎng)絡(luò)模式”中處于中心地位。故現(xiàn)有的研究主要集中在C5a影響中性粒細(xì)胞、大血管內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá)方面。但由于凝血異常主要發(fā)生在微小血管,尤其是肺作為MODS首發(fā)靶器官,故C5a對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF的影響以及機(jī)制更值得關(guān)注。
　　 在縱多參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子中,核因子-κB(Nuclear factor kappB,NF-κB)是研究的焦點(diǎn)。它存在于體內(nèi)多種細(xì)胞中,是一種可調(diào)控多種功能蛋白分子表達(dá)而參與

7、多種疾病發(fā)病過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子。激活的NF-κB二聚體通過(guò)核易位與目的基因啟動(dòng)區(qū)κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。它主要參與炎癥反應(yīng)與炎癥損傷相關(guān)蛋白分子的表達(dá)調(diào)控,如促炎細(xì)胞因子(包括TNF-α、ILs等)、黏附分子、急性期蛋白及可誘導(dǎo)的效應(yīng)期酶等。由于TF基因的啟動(dòng)區(qū)包含了包括NF-κB等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。因此,NF-κB在TF基因表達(dá)調(diào)控中的作用值得探討。
　　 組織因子途徑抑制物(tissue factor path

8、way inhibitor,TFPI)是TF啟動(dòng)機(jī)體凝血過(guò)程中的重要生理抑制物。機(jī)體凝血正常狀態(tài)的維持有賴于TF與TFPI之間的平衡。人們?cè)诙喾N動(dòng)物疾病模型如冠心病、腦梗塞、白血病等血標(biāo)本中檢測(cè)到TF和TFPI的異常,用二者的變化作為疾病病程中凝血異常的一種解釋。由于凝血異常也是膿毒癥的一種突出表現(xiàn),是否在動(dòng)物模型上也能發(fā)現(xiàn)TF和
　　 TFPI的異常的變化,我們合成的C5a反義肽能否在體內(nèi)拮抗C5a引起凝血異常的生物學(xué)活性也有

9、待驗(yàn)證。
　　 為此:在廣州市科委攻關(guān)引導(dǎo)項(xiàng)目(0723-E0121)的資助下,本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)行以下研究:
　　 1)C5a對(duì)HPMEC TF表達(dá)的影響:以微血管內(nèi)皮細(xì)胞HPMEC株作為研究對(duì)象,觀察不同時(shí)間(C5a濃度200ng/ml刺激細(xì)胞4h、8h、12h)、不同濃度(C5a濃度100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml刺激細(xì)胞8h)C5a與TF表達(dá)的關(guān)系,利用適時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡方法,檢測(cè)TF基因和

10、蛋白水平的變化情況。了解C5a刺激濃度和刺激時(shí)間對(duì)HPMEC表達(dá)TF的影響。
　　 2)C5a促進(jìn)TF表達(dá)可能的機(jī)制:選定C5a濃度200ng/ml刺激8h組為觀察對(duì)象,分兩組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。干預(yù)組:加入C5a反義肽(2ug/m1)以阻斷CSa與細(xì)胞膜表面C5aR的結(jié)合；對(duì)照組:不加反義肽。觀察TF基因和蛋白變化。C5a刺激細(xì)胞后用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察胞內(nèi)NF-κB p65表達(dá)變化,與正常HPMEC比較,觀察p65活化情況。
　

11、　 3)膿毒癥動(dòng)物血液TF和TFPI的變化:對(duì)昆明小鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù),復(fù)制膿毒癥動(dòng)物模型,分正常組、假手術(shù)組、模型組、反義肽干預(yù)組,在不同時(shí)間點(diǎn)(2h、4h、8h、12h)用ELISA方法,檢測(cè)血液中TF和TFPI的濃度變化。了解膿毒癥TF與TFPI的變化情況,以及C5a拮抗對(duì)TF與TFPI失衡的作用。
　　 研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1、C5a對(duì)HPMEC TF表達(dá)的影響:
　　 正常的HPME

12、C基本檢測(cè)不到TF基因和蛋白的表達(dá)。C5a刺激時(shí)間與HPMEC的TF表達(dá)的關(guān)系,以200ng/ml濃度的C5a刺激HPMEC時(shí),作用時(shí)間為4h、8h、12h的基因表達(dá)定量為(1.00±0.13)、(3.04±0.26)、(6.58±0.44),p<0.05；而其相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)TF的蛋白合成定量為(0.15±0.05)、(0.27±0.06)、(0.45±0.07).p<0.05。
　　 C5a刺激濃度與HPMEC的TF表達(dá)的關(guān)系,

13、以C5a對(duì)HPMEC作用時(shí)間8h,C5a濃度分別為100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml,TF基因表達(dá)定量分別為(1.00±0.14)、(1.80±0.16)、(3.09±0.09),p<0.05；而其蛋白合成定量分別為(0.29±0.05)、(0.41±0.73)、(0.53±0.40),p<0.05。
　　 2、C5a增加TF表達(dá)可能的機(jī)制:
　　 C5a反義肽干預(yù)后,與不干預(yù)組相比,TF基因?yàn)?1.0

14、0±0.10)和(0.66±0.67),p<0.05；而蛋白定量為(0.33±0.34)和(0.27±0.31),p<0.05。
　　 NF-κB p65免疫組化示:陰性對(duì)照組細(xì)胞胞漿無(wú)黃褐色顆粒,正常對(duì)照組胞漿有淡染的黃褐色顆粒；而200ng/ml C5a刺激8h組胞漿出現(xiàn)深染的黃褐色顆粒。正常細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)無(wú)黃染顆粒,而經(jīng)200ng/ml C5a刺激后細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃褐色顆粒。
　　 3、膿毒癥動(dòng)物血液TF和TFPI的變

15、化:
　　 時(shí)間點(diǎn)為2h時(shí),正常組、假手術(shù)組、造模組和反義肽干預(yù)組小鼠血液TF的濃度分別為:(42.44±2.19)pg/ml、(54.12±3.47)pg/ml、(59.81±3.69)pg/ml、(54.23±3.73)pg/ml。時(shí)間點(diǎn)為4h時(shí),各組小鼠血液TF的濃度分別為:(42.29±1.98)pg/ml、(53.70±4.14)pg/ml、(82.77±9.11)pg/ml、(70.91±7.19)pg/ml。時(shí)間點(diǎn)

16、為8h時(shí),各組小鼠血液TF的濃度分別為:(41.45±1.32)pg/ml、(56.33±2.68)pg/ml、(125.34±6.32)pg/ml、(103.36±6.72)pg/ml。時(shí)間點(diǎn)為12h時(shí),各組小鼠血液TF的濃度分別為:(42.75±1.25)pg/ml、(60.73±1.43)pg/ml、(139.81±6.17)pg/ml、(121.41±7.21)pg/ml。TF濃度隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì),各時(shí)間點(diǎn)反義肽干預(yù)組

17、與造模組相比,TF濃度均低于造模組,p<0.05。
　　 這說(shuō)明,膿毒癥早期便出現(xiàn)了凝血異常,表現(xiàn)在TF與TFPI的不平行升高。予以C5a反義肽治療后,血液中的TFPI并沒(méi)有明顯的改變,故它影響凝血的過(guò)程可能主要是通過(guò)減少TF的產(chǎn)生,從而影響TF、TFPI之間的平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 本次實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)水平對(duì)C5a與TF表達(dá)的關(guān)系做了初步的研究。從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)了TF在12h內(nèi)隨著C5a刺激時(shí)間和刺激濃度有明顯

18、的上調(diào)表達(dá)；C5a與受體結(jié)合介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào),通過(guò)NF-κB活化、核易位調(diào)控TF基因和蛋白表達(dá)可能是其重要途徑；同時(shí)驗(yàn)證了合成的C5a反義肽在體外部分拮抗C5a生物活性的作用。
　　 從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠存在凝血與抗凝平衡失調(diào),表現(xiàn)在TF與TFPI的不平行升高；用C5a反義肽進(jìn)行干預(yù)后,小鼠的凝血紊亂有一定程度的糾正,證實(shí)了C5a對(duì)膿毒癥發(fā)生凝血與抗凝失衡的影響,同時(shí)也驗(yàn)證了合成的C5a反義肽在體內(nèi)具有部分拮抗C5a的生