骨碎補對骨生長因子表達影響的實驗研究.pdf

1、1研究設計隨機、盲法、對照、細胞培養(yǎng) 2研究背景隨著社會的發(fā)展，交通運輸業(yè)的繁榮，各種運動的頻繁開展，各種創(chuàng)傷、骨折已經成為臨床常見病及多發(fā)病，嚴重危脅人類的健康和影響人們的勞動能力。如何早日促進骨折愈合，是骨傷科領域的重點課題。中藥治療骨折具有悠久的歷史，并取得了卓越的臨床療效。是目前治療骨折的主要手段之一。由于中醫(yī)學在認識論、方法論上的特殊觀、導致了它在闡述藥物作用機制仍停留在宏觀的水平。如何保持和發(fā)揚中醫(yī)骨傷科的骨折治療特

2、色與優(yōu)勢，使中醫(yī)藥現代化走向世界是不可回避的問題。 骨折愈合是極其復雜的生物學修復過程。多年以來，國內外學者借助組織學、組織化學組織形態(tài)計量學，超微結構與生物力學等手段對骨折進行了大量的實驗觀察，對骨折愈合機制也進行了廣泛的探討。臨床上應用了促進骨折愈合的多種方法，但骨折延遲愈合，不愈合的問題仍未完全解決，近年來，由于基因技術的發(fā)展應用，人們對骨折愈合的認識已從細胞生物學向分子生物學水平深化，并隨著分子生物學的不斷發(fā)展，已經認識

3、到骨折愈合與多種生物因子有關，除內分泌、代謝因子等全身因子外骨折局部尚有大量的生長因子，對骨折愈合起著重要的調節(jié)作用。 中藥對骨折愈合相關基因的作用的研究近年來也已經有了初步的進展，導師董?；劢淌陬I導的課題：“中藥對骨折愈合過程中相關細胞信號傳導系統(tǒng)調控的研究”即是從分子生物學水平探討中藥促進骨折愈合的機理，并且利用動物模型已經完成了中藥阿膠、骨碎補、海螵蛸、水蛭等對骨折愈合過程中相關基因表達的研究，揭示出了不同中藥在不同時相對

4、不同基因表達的影響，為中藥促進骨折愈合提供了理論基礎。中藥與骨折愈合過程中相關基因表達的研究目前尚處于起步階段，目前的研究主要集中于中藥對動物模型的作用方面，中藥與體外成骨細胞培養(yǎng)的研究主要集中在中藥促進成骨細胞的增殖方面，而利用體外成骨細胞培養(yǎng)技術研究中藥骨碎補與骨折愈合過程中相關基因表達的影響尚未見報道。 3研究目的觀察中藥骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞增殖功能的影響，以及中藥骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞TGF-β1，TGF-

5、βRⅡ、VEGF、bFGF及基因表達的影響，從分子生物學水平探討骨碎補對骨折愈合的作用機制，為中藥促進骨折愈合提供理論基礎。從而指導臨床骨折的治療。 4材料與方法實驗材料：骨碎補制備原藥液和含藥學清，用Wistar乳大鼠顱蓋骨分離原代成骨細胞。實驗用藥劑量：骨碎補原藥液根據預試驗分為5mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL三個劑量組；含藥學清制備按人鼠體表面積法換算，以成人臨床等效劑量的7倍為低劑量組，低劑量組的2倍為中劑量

6、組，低劑量組的4倍為高劑量組。每日給藥2次，連續(xù)給藥3d后處死取血清。實驗分組：空白血清對照組，細胞模型對照組，骨碎補原藥液低劑量組(0.1mg/mL)，骨碎補原藥液中劑量組(1mg/mL)，骨碎補原藥液高劑量組(5mg/mL)，骨碎補含藥血清低劑量組，骨碎補含藥血清中劑量組，骨碎補含藥血清高劑量組。實驗干預：用骨碎補原藥液和含藥學清作用于第二代、第三代成骨細胞。標本處理：免疫組化，取24孔板，將1×1cm玻片進行處理后放入，取大鼠成骨

7、細胞以4×103的密度種植于24孔板中，繼續(xù)用10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。吸棄上清液加入10﹪血清的各條件液進行培養(yǎng)，48小時后吸棄上清，并用PBS(0.1M，PH7.4)洗三次，用10﹪甲醛溶液固定30min后備用。RT-PCR，取大鼠成骨細胞以4×103的密度種植于12孔板中，繼續(xù)用10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，吸棄上清液，加入10﹪血清的各條件液進行培養(yǎng)，48小時后吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，冷PBS(0.

8、01M，PH7.4)沖洗2次，加入TRIzol，每孔0.5ml，反復吹打3min，吸取TRIzol液放入1.5mlEppendorf管中，22℃靜止5min。然后放入-70℃冰箱中備用。檢測：MTT法檢測細胞增值率；RT-PCR法檢測TGF-β1mRNA、TGF-βRⅡmRNA、VEGFmRNA、bFGFmRNAmRNA；免疫組化檢測TGF-β1、TGF-βRⅡ、VEGF、bFGF表達，應用計算機圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，對骨生長因子表

9、達陽性細胞進行平均灰度測定。 5結果5.1骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞增殖功能的影響本實驗研究結果：與空白血清對照組比較，細胞模型對照組、骨碎補原藥液低劑量組、骨碎補原藥液中劑量組、骨碎補原藥液高劑量組和骨碎補含藥血清高劑量組的OD值明顯降低(P＜0.01)，骨碎補含藥血清低劑量組和骨碎補含藥血清中劑量組變化不明顯(P＞0.05)。與細胞模型對照組比較，骨碎補含藥血清低劑量組和骨碎補含藥血清中劑量組的OD值明顯升高(P＜0.01

10、)，骨碎補原藥液高劑量組明顯降低(P＜0.01)，骨碎補原藥液低劑量組、骨碎補原藥液中劑量組和骨碎補含藥血清高劑量組變化不明顯(P＞0.05)。從總體上看，骨碎補含藥血清組較骨碎補原藥液組OD值升高(P＜0.05)。 5.2骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞TGF-β1、TGF-βRⅡ、VEGF、bFGF及基因表達的影響 5.2.1骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞TGF-β1及基因表達的影響本實驗研究結果：與空白血清對照組比較，骨

11、碎補原藥液的三個劑量組和骨碎補含藥血清的低、中劑量組，TGF-β1mRNA的表達減少(P＜0.05)，骨碎補含藥血清的高劑量組沒有明顯差異(P＞0.05)。與細胞模型對照組比較，空白血清對照組表達增加(P＜0.05)。其余無差異(P＞0.05)。TGF-β1表達結果：與空白血清對照組比較，各組間無顯著差異(P＞0.05)。與細胞模型對照組比較，各組間無顯著差異(P＞0.05)。TGF-βRⅡmRNA表達結果：與空白血清對照組比較，骨碎補

12、原藥液的低、中劑量組和骨碎補含藥血清的中劑量組表達減少(P＜0.05)，與細胞模型對照組比較，骨碎補原藥液的低劑量組和骨碎補含藥血清的中劑量組表達減少，骨碎補含藥血清的高劑量組表達增加(P＜0.01)。 5.2.2骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞VEGF及基因表達的影響本實驗研究結果：與空白血清對照組比較，細胞模型組無顯著差異(P＞0.05)，骨碎補原藥液的三個劑量組和骨碎補含藥血清的低劑量組VEGFmRNA表達減少(P＜0.01)

13、，骨碎補含藥血清的中、高劑量組VEGFmRNA表達明顯增加(P＜0.01)。與細胞模型對照組比較，空白血清組VEGFmRNA的表達無顯著差異(P＞0.05)，骨碎補原藥液的三個劑量組和骨碎補含藥血清的低劑量組VEGFmRNA表達減少(P＜0.01)，骨碎補含藥血清的中劑量組VEGFmRNA表達略增加，但無顯著意義(P＞0.05)。骨碎補含藥血清的高劑量組VEGFmRNA表達明顯增加(P＜0.01)。VEGF表達結果：與空白血清對照組比較

14、，細胞模型對照組、骨碎補原藥液低、高劑量組表達無差異(P＞0.05)，骨碎補原藥液中劑量組表達明顯減少(P＜0.01)、骨碎補含藥血清低劑量組表達減少(P＜0.05)，骨碎補含藥血清中劑量組表達增加(P＜0.05)，骨碎補含藥血清高劑量組表達明顯增加(P＜0.01)。與細胞模型對照組比較，空白血清對照組、骨碎補原藥液低、高劑量組表達無差異(P＞0.05)，骨碎補原藥液中劑量組明顯減少(P＜0.01)、骨碎補含藥血清低劑量組表達減少(P＜

15、0.05)，骨碎補含藥血清中劑量組表達增加(P＜0.05)，骨碎補含藥血清高劑量組表達明顯增加(P＜0.01)。 5.2.3骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞bFGF及基因表達的影響本實驗研究結果：與空白血清對照組比較，細胞模型對照組、骨碎補原藥液的低、中劑量組bFGFmRNA表達減少(P＜0.01)，骨碎補原藥液的高劑量組bFGFmRNA無差異(P＞0.05)，骨碎補含藥血清的三個劑量組bFGFmRNA表達均明顯增加(P＜0.01)

16、。與細胞模型對照組比較，空白血清對照組、骨碎補原藥液高劑量組及骨碎補含藥血清的三個劑量組bFGFmRNA表達均明顯增加(P＜0.01)。并且骨碎補含藥血清的三個劑量組bFGFmRNA表達均明顯高于骨碎補原藥液三個劑量組(P＜0.01)。與空白血清對照組比較，細胞模型對照組、骨碎補原藥液低、高劑量組和骨碎補含藥血清低劑量組bFGF表達無差異(P＞0.05)，骨碎補原藥液中劑量組bFGF表達減少(P＜0.05)，骨碎補原藥液高劑量組和骨碎補

17、含藥血清低、中、高劑量組bFGF表達明顯增加(P＜0.01)。與細胞模型對照組比較，骨碎補原藥液高劑量組、骨碎補含藥血清三個劑量組表bFGF達明顯增加(P＜0.01)，其余無明顯差異(P＞0.05)。 6結論6.1骨碎補對成骨細胞的增殖沒有明顯的促進作用，并且，當骨碎補的濃度達到一定時，還對成骨細胞的增殖有抑制作用。 6.2骨碎補對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞TGF-β1及TGF-β1mRNA的表達沒有明顯促進作用；而骨碎補對體